贵阳医学院2014届硕士研究生论文
处）。
(3)然后用剥离尺将PAGE胶轻轻撬起用于转膜放入转移液中。
6.转膜
（1）准备1张pvdf膜和6张滤纸，根据膜的大小切出同等大小的pvdf膜和滤纸。
（2）在加有转移液的盘里放入转膜用海绵、6张滤纸和pvdf膜。
（3）将转膜夹子打开使黑色的一面保持水平。在上面放一张海绵，在海绵上放三层滤纸。
（4）剥胶，撬玻璃板的时候动作要轻，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶，调整其与滤纸四边距离，放于滤纸上面并与之对齐。在分离胶上放上pvdf膜，再盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上海绵垫。
（5）将转膜夹放入加入转膜缓冲液的槽中,转膜时会产热，注意降温。一般用250mA转移 2.5h 。
7. 免疫反应
（1）将膜用 TBS 浸湿后，移至封闭液中，于摇床上封闭1h。
（2）将一抗用 TBST 稀释，将抗体溶液加到保鲜袋中；从封闭液中取出膜，将膜放于保鲜袋中，4度过夜，隔天从4度冰箱取出放在摇床上1h，一抗孵育后室温下加TBST在摇床上洗三次，每次 8min；
（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，摇床孵育 1h 后，室温下用TBST 在摇床上洗三次，每次8min。
8. 化学发光，显影，定影
（1）将 A 和 B 两种试剂在保鲜膜上1:1的比例混合；1min 后，将pvdf膜与AB混合液接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X-光片夹中。
（2）在暗室中，将 1³显影液和定影液分别到入盘中；在红灯下取出 X－光片，用剪刀剪裁适当大小；打开 X-光片夹，把 X－光片放在膜上（一旦放上，便不能移动），关上 X-光片夹根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。
（3）曝光完成后，打开 X-光片夹来取出 X-光片，之后迅速浸入显影液中显影，
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