细胞骨架荧光染色2

细胞爬片及细胞骨架组分的荧光染色观察

实验目的

1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。

3. 为细胞骨架的观察提供实验材料

4. 学习荧光显微镜的工作原理及使用方法。 5.掌握细胞骨架的显示方法

6.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构

7.了解荧光探针Hoechst 33342（Ho.33324）与细胞成分的结合特性和光谱特性。

实验原理

细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。

细胞骨架(cytoskeleton）是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。本次试验使用鬼笔环肽对微丝进行染色。

鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。

由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法.

Hoechst 33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为350 nm和461 nm。 罗丹明123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明123具有正电荷，两者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发射波长为507 nm和529 nm。

试验方法

材料：鸡胚成纤维细胞 试 剂:

1. 细胞爬片：DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶

2. 细胞骨架荧光染色：PEM缓冲液（50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M

山梨醇），0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中，4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。

仪器及用品：

超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜、盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、小盖玻片、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。

步骤：

1.将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。

2.用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。

3.打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。

4.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，使其湿润整个细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。

5. 显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。

6. 加两滴管含10üS的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，

7. 用无菌小镊子将处理好的小载玻片放入35mm培养皿中，加入细胞悬液到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘，稍微静置，继续滴加培养基覆盖培养皿底部。 8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养至细胞融合度达70%～80%。

9. 取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温 PEM轻轻漂洗3次。 10. 加入37℃预温 4%多聚甲醛固定15min 。 11. 用37℃预温PEM漂洗3次。

12. 加入0.5 % Triton X-100通透处理约10 min 13. 用37℃预温 PEM漂洗3次。 14. 取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上上滴加20 μL 60 nM Alex –phalloidin，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵育于染色液中，于湿盒中室温避光染色30 min。

15. 小心取下盖玻片，将其置于小平皿中，用37℃预温 PEM避光漂洗3次。 16.在parafilm膜上滴加Ho.33342工作液各10 μL，将盖玻片上的细胞倒扣在parafilm膜上室温暗处孵育10 min。

17. 荧光显微镜观察微丝（绿光激发，产生红色荧光） 核（紫外光激发，产生蓝色荧光）

18.使用emageJ软件将两种染色的照片拼合。

实验结果

鸡胚成纤维细胞细胞骨架荧光染色

鸡胚成纤维细胞的生长状况较好，有一定数目的细胞附着在玻片上，所以可用于骨架荧光染色。染色后微丝呈红色，细胞核为蓝色，染色较为清晰。

分析与讨论

细胞内的微丝在含有ATP和Ca2+及低浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，趋于解聚成G-actin；而在Mg2+和高浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，G-actin则装配为F-actin。PEM缓冲液提供高Mg环境，让单体肌动蛋白（G-actin）聚合成丝状肌动蛋白（F-actin）。同时，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin装配成F-actin，微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用PEM缓冲液处理细胞，能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。

0.5%Triton X-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。

鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。

鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。

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