临床医学1,25(OH)2D3抑制肝癌细胞HDAC2活性和促进p21 WAFICIP1(14)

贵阳医学院2014届硕士研究生论文

2.8 肝癌细胞HepG2核蛋白的提取

（1) 试剂盒中的三种试剂于室温融解，溶解后立刻放置冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞核蛋白抽提试剂，在使用前数分钟内加入PMSF 使PMSF的最终浓度1mM。

(2) 从培养箱取一瓶处于对数生长期的肝癌细胞HepG2，弃去细胞培养基后用PBS 3ml洗涤细胞两次后用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打及离心收集细胞，留下细胞沉淀备用。

(3) 根据沉淀的量按比例加入临时添加PMSF的浆蛋白提取试剂A（20ul:200ul）。

(4) 以最高的速度Vortex 使细胞沉淀完全悬浮分散开，时间为5秒。

(5) 冰浴14分钟。

(6) 冰浴后使加入10ul的浆蛋白抽提试剂B的溶液以最高的速度剧烈涡旋5秒，之后冰浴1分钟。

(7) 冰浴后以最高的速度涡旋5s，接着4℃离心机以 12000-16000g/5min。

(8) 马上把上清(细胞浆蛋白)吸出放入预先冷置的5mlepp管中。把50ul的核蛋白抽提试剂加入剩下的沉淀中。以最高的速度涡旋 25s，使细胞得沉淀完全悬浮分散开。之后放回冰浴中，每隔2分钟再高速涡旋25s,整个过程共30分钟。

(9) 放入4℃的离心机离心12000-16000g/10min。

(10) 马上把上清(细胞核蛋白)吸出放入预先冷置的5mlepp管中。可以马上使用，也可以-70℃冻存。

2.9 BCA蛋白浓度测定

(1)蛋白标准溶液(25mg/ml)配置：蛋白标准配制液和BSA配置比例(0.8ml：20mg）。

(2)把蛋白标准溶液浓度稀释至0.5mg/ml。

(3) 依据样品数量，按BCA试剂A与BCA试剂B按50:1的比例配制适量BCA工作液，充分混匀（如5ml BCA试剂A加100ul BCA试剂B),混匀，配制成5.1ml BCA 工作液。 BCA工作液室温24小时内稳定。

（4）将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 2096孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul。

(5) 加适当的体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20ul。

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