临床医学1,25(OH)2D3抑制肝癌细胞HDAC2活性和促进p21 WAFICIP1(10)

贵阳医学院2014届硕士研究生论文

10 （4）加入含10%胎牛血清及含谷氨酰胺的DMEM 高糖培养基，用移液器轻轻吹打混匀后移入细胞培养瓶中。

（5）将细胞培养瓶置于含5%二氧化碳孵箱中37℃培养，每1-2天更换细胞培养基。

2.1.4细胞冻存

冻存前一天换液，取对数生长期的细胞，胰酶消化后1000rpm 离心，加入细胞冻存液(90%FBS,10%DMSO)1ml ，吹打均匀后放入细胞冻存管，转移至程序降温仪中，4小时后投入液氮中。

2.2 CCK-8检测1,25（OH ）2D 3对肝癌细胞抑制作用

2.2.1实验分组

正常对照组：10%FBS 的高糖DMEM

乙醇对照组：10%FBS 的高糖DMEM ＋无水乙醇（浓度小于0.01%）

实验组： V1：10%FBS 的高糖DMEM ＋10-6mol/L1,25（OH ）2D 3

V2: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-7mol/L1,25（OH ）2D 3

V3: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-8mol/L1,25（OH ）2D 3 V4: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-9mol/L1,25（OH ）2D 3

V5: 10%FBS 的高糖DMEM ＋10-10mol/L1,25（OH ）2D 3

2.2.2 cck-8检测步骤

（1）在24孔板里培养肝癌HpG2细胞，分别于一周内每天天消化细胞进行计数，得出细胞生长曲线。 （2）取处于生长对数期的肝癌细胞，在96孔板中接种细胞悬液（8³103/孔），将96板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO 2）。

（3）细胞贴壁后，对实验组和对照组进行饥饿培养3H ，后根据实验分组，加入1,25（OH ）2D 3培养细胞，设无细胞组为空白对照组，每组设5个复空，分别于

24,48和72小时后向每孔加入10 μL CCK 溶液和90ul 的细胞培养基。

（4）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

（5）用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

2.3 HepG2细胞RNA 的提取

采用RNAprep Pure Cell Kit 提取HepG2细胞总RNA ，操作步骤按RNAprep Pure Cell Kit 试剂盒说明书进行。实验过程所用物品用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC ）

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