16S_rDNA鉴定细菌的方法(6)

Step 1: DNA热变性；Step 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸

2.2 PCR反应标准体系

DNA模板

引物

反应缓冲液

dNTP

ddH2O

耐热聚合酶

2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件

ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加

反应特异性。

dNTP:反应体系中达100μM～200μM。

Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特

异性降低。

引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－

70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。

Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５

０％活力。

变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。

复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应

特异性的决定因素。

延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。

2.2.2 材料设备及试剂

设备：eppendorf管、微量取液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪

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