16S_rDNA鉴定细菌的方法(4)

（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。

用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。

用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl

loading buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。

2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增

一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

2.1 实验原理

2.1.1 PCR

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。

PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理

2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析

16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上

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