16S_rDNA鉴定细菌的方法(2)

12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。

13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）

14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。

15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）

1.1细菌基因组DNA提取

基本步骤：

基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪

细菌基因组DNA提取方法综述

细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。

1 快速微量提取法

取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，

收集菌体。

加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）

混匀,置于37oC水浴1hr。

然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，

13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备

用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.

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