16S_rDNA鉴定细菌的方法(10)

pH值适当

避免污染

8 PCR常见问题与分析

8.1 无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因：

1. 模板:含有抑制物，含量低

2. Buffer对样品不合适

3. 引物设计不当或者发生降解

4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策：

1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2. 更换Buffer或调整浓度

3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

4. 降低退火温度、延长延伸时间

8.2 非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因：

1. 引物特异性差

2. 模板或引物浓度过高

3. 酶量过多

4. Mg2+浓度偏高

5. 退火温度偏低

6. 循环次数过多

对策：

1. 重新设计引物

2. 适当降低模板或引物浓度

3. 适当减少酶量

4. 降低镁离子浓度

5. 适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6. 减少循环次数

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