发酵工程毕业论文完成版 - 图文(8)

3 结果与讨论

酶切，获得3280 bp和1613 bp大小的特异性条带，这些片段大小均与预期结果一致，基本证明重组质粒构建成功，然后将质粒送往测序公司进行基因测序，结果证明重组质粒构建正确，其中KanMX与BA和BB连接方向相反。

图3-4 重组质粒pUC-BA、pUC-BAB和pUC-BABK的酶切验证

Fig.3-4 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmids pUC-BA, pUC-BAB and

pUC-BABK

M：DL5000 DNA marker；1：pUC-BA/EcoRI-BamHI；2：pUC-BAB/PstI-BamHI；

3：pUC-BABK/BamHI

3.1.3 BAT1基因敲除突变株的获得及验证

3.1.3.1 重组片段的获得

以构建好的重组质粒pUC-BABK为模板，利用引物BA-U和BB-D扩增2207 bp的重组片段BA-KanMX-BB，电泳检测目的片段，结果如图3-5。结果显示PCR扩增产物单一，特异性条带大小正确。

图3-5重组片段BA-KanMX-BB的PCR产物 Fig.3-5 PCR recombinant fragment BA-KanMX-BB M：DL5000 DNA Marker；1：BA-KanMX-BB

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3.1.3.2 突变株的获得及验证

将重组片段BA-KanMX-BB的PCR产物回收，然后通过醋酸锂转化法将重组片段分别导入黄酒酵母单倍体RY1-a1与RY1-α3，通过BA片段和BB片段与酵母染色体上BAT1基因两侧的同源序列同时发生同源重组（图3-6），从而整合到酵母染色体上并随其一起复制，重组过程实现了BAT1基因被KanMX基因完全替换，从而实现BAT1基因的敲除，KanMX基因的引入使突变株产生G418抗性，可以作为筛选标记。根据出发菌株已知的G418抗性临界浓度，选用含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板筛选突变株。若基因片段BA-KanMX-BB已整合到出发菌株的染色体中，则会在含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板上生长。

图3-6 BA-KanMX-BB片段与黄酒酵母基因组同源重组过程

Fig.3-6 Double homologous recombination between BA-KanMX-BB cassette and BAT1 gene in yellow

wine yeast

挑取G418平板上长出的转化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液体培养基中培养，并提取其基因组，然后以此基因组DNA作为模板，进行PCR验证。根据酿酒酵母基因组上重组位点两端的基因序列和插入片段的序列，分别设计两组上下游引物B-S和K-S-BAT1、K-X-BAT1和B-X用以验证转化子。利用引物B-S和K-S-BAT1可从转化子中扩增出大小为1904 bp的上游验证产物（图3-7，泳道2），利用引物K-X-BAT1和B-X可从转化子中扩增出大小为1188 bp的下游验证产物（图3-6，泳道4），而出发菌株则无扩增产物(图3-7，泳道1和3)，PCR扩增出的产物大小与预期相同，此结果说明基因片段BA-KanMX-BB已经成功整合到黄酒酵母染色体BAT1基因位点上，替代敲除了BAT1基因，即BAT1基因敲除单倍体突变株构建成功，命名为RY1-a1-?bat1和RY1-α3-?bat1。

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3 结果与讨论

图3-7 BAT1基因敲除突变株的PCR验证 Fig.3-7 PCR confirmation of mutant strain RY1-a1-?bat1

M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1-a1的基因组为模板，以B-S和K-S-BAT1为引物进行PCR扩增的产物；2：以RY1-a1-?bat1的基因组为模板，以B-S和K-S-BAT1为引物进行PCR扩增的产物；3：以RY1-a1的基因组为模板，以B-X和K-X-BAT1为引物进行PCR扩增的产物；4：以

RY1-a1-?bat1的基因组为模板，以B-X和K-X-BAT1为引物进行PCR扩增的产物

3.1.4 BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响

3.1.4.1 BAT1基因敲除突变株与出发菌株基本发酵性能的比较

将构建好的BAT1基因敲除突变株RY1-a1-?bat1、RY1-α3-?bat1与出发菌株同时进行黄酒发酵实验，发酵过程中记录CO2失重情况，发酵结束后测量发酵液中的残糖含量，蒸馏发酵液并测量其酒精含量，结果见表3-1所示。

表3-1 BAT1基因敲除突变株与出发菌株基本发酵性能的比较

Table 3-1 Basic fermentation performances of BAT1 mutant strains and parent strains

菌株

CO2累计失重

（g）

RY1-a1 RY1-α3 RY1-a1-?bat1 RY1-α3-?bat1

30.3 30.2 30.2 30.1

酒度 （%，v/v）

14.2 14.1 14.1 14.0

残糖 （g/100 mL）

0.92 0.86 0.75 0.97

从表中可以看出，BAT1基因敲除突变株RY1-a1-?bat1、RY1-α3-?bat1的CO2累计分别为30.2 g和30.1 g，发酵液蒸馏后酒度分别是14.1度和14.0度，结果均与出发菌株接近，同时残糖量也都低于1 g/100mL，表示BAT1基因敲除突变株与出发菌株发酵均很彻底。发酵结果说明敲除BAT1基因对黄酒酵母基本发酵性能无明显影响。 3.1.4.2 BAT1基因敲除突变株与出发菌株高级醇生成量的比较

BAT1基因敲除突变株与出发菌株黄酒发酵结束后，取发酵液的蒸馏液进行气相

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色谱分析，检测突变株与出发菌株发酵产高级醇的含量，结果见表3-2。

表3-2 BAT1基因敲除突变株与出发菌株高级醇生成量比较

Table 3-2 Higher alcohols production of BAT1 mutant strains and parent strains 菌株

正丙醇 （mg/L）

RY1-a1 RY1-α3 RY1-a1-?bat1 RY1-α3-?bat1

102.52 103.79 100.27 101.77

异丁醇 （mg/L） 159.24 155.39 157.68 150.35

异戊醇 （mg/L） 352.75 358.11 355.51 362.83

从表中可以看出，出发菌株RY1-a1产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为102.52 mg/L、159.24 mg/L和352.75 mg/L，突变株RY1-a1-?bat1产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为100.27 mg/L、157.68 mg/L和355.51 mg/L；出发菌株RY1-α3产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为103.79 mg/L、155.39 mg/L和358.11 mg/L，突变株RY1-α3-?bat1产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为101.77 mg/L、150.35 mg/L和362.83 mg/L。由气相检测结果可以看出，BAT1基因敲除突变株与出发菌株高级醇生成量无明显差异，结果说明BAT1基因敲除对黄酒酵母单倍体菌株生成高级醇的含量无明显影响。

3.1.5 小结与讨论

通过对BAT1基因敲除突变株RY1-a1-?bat1、RY1-α3-?bat1与出发菌株RY1-a1、RY1-α3分别进行黄酒发酵实验，发酵结果表明，与出发菌株相比，突变株的高级醇生成量及基本发酵性能均无明显变化，表明敲除BAT1基因对黄酒酵母高级醇代谢无显著影响。推测其可能原因为，由于支链氨基酸转氨酶分为线粒体支链氨基酸转氨酶和细胞质支链氨基酸转氨酶两种，分别由BAT1基因和BAT2基因编码，两种转氨酶都具有氨基酸的分解和合成作用，单独敲除BAT1基因后，酿酒酵母可能通过调控BAT2基因的表达，使其编码的细胞质支链氨基酸转氨酶能够满足其自身的分解及合成氨基酸的能力，从而对其发酵的基本性能和产高级醇能力没有造成显著影响。另外一个原因可能是高级醇的形成包括氨基酸分解代谢途径和糖代谢途径，代谢途径复杂，敲除BAT1基因使氨基酸代谢途径受阻后，酵母也可通过糖代谢途径形成高级醇。

3.2 BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 3.2.1 BAT1、BAT2基因双敲除突变株的获得及验证

通过醋酸锂转化法将重组片段BA-KanMX-BB分别导入BAT2基因敲除突变株RY1-a1-?bat2和RY1-α3-?bat2，通过同源重组过程实现了BAT1基因被KanMX基因完全替换，从而实现BAT1基因的完全敲除。挑取G418平板上长出的转化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液体培养基中培养，并提取其基因组，然后以此基因组DNA

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3 结果与讨论

作为模板，进行PCR验证。利用引物B-S和K-S-BAT1可从转化子中扩增出大小为1904 bp的上游验证产物（图3-8，泳道2），利用引物K-X-BAT1和B-X可从转化子中扩增出大小为1188 bp的下游验证产物（图3-6，泳道4），而出发菌株则无扩增产物(图3-8，泳道1和3)，PCR扩增出的产物大小与预期相同，此结果说明基因片段BA-KanMX-BB已经成功整合到黄酒酵母染色体BAT1基因位点上，替代敲除了BAT1基因，即BAT1、BAT2基因双敲除单倍体突变株构建成功，命名为RY1-a1-?bat1?bat2和RY1-α3-?bat1?bat2。

图3-8 BAT1、BAT2基因双敲除突变株RY1-a1-?bat1?bat2的PCR验证

Fig.3-8 PCR confirmation of mutant strain RY1-a1-?bat1?bat2

M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1-a1的基因组为模板，以B-S和K-S-BAT1为引物进行PCR扩增的产物；2：以RY1-a1-?bat1?bat2的基因组为模板，以B-S和K-S-BAT1为引物进行PCR扩增的产物；3：以RY1-a1的基因组为模板，以B-X和K-X-BAT1为引物进行PCR扩增的产物；4：以RY1-a1-?bat1?bat2的基因组为模板，以B-X和K-X-BAT1为引物进行PCR扩增的产物

3.2.2 突变株与出发菌株生长性能的比较

按照方法2.2.5测定BAT1、BAT2基因双敲除突变株及其单敲除突变株与出发菌株的生长曲线。从图3-9可以看出，突变株和出发菌株都经历了延滞期、对数期和稳定期3个阶段。其中BAT1、BAT2基因单敲除突变株的整体生长趋势和菌体密度与出发菌株都基本保持一致，而BAT1、BAT2基因双敲除突变株生长繁殖进入对数期后，繁殖速度明显比BAT1、BAT2基因单敲除突变株和出发菌株慢，说明BAT1、BAT2基因双敲除对菌株的生长繁殖影响显著。

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