发酵工程毕业论文完成版 - 图文(5)

天津科技大学硕士学位论文

2.1.3 菌种与质粒

本实验中所使用的黄酒酵母菌株、大肠杆菌菌株和质粒载体如表2-3所示：

表2-3本实验所使用菌株和质粒的性质及来源 Table 2-3 Strains and plasmids used in this study

菌株或质粒 菌株（Strains） RY1 RY1-a1 RY1-α3 RY1-a1-?bat2 RY1-α3-?bat2 RY1-1 RY1-2 RY1-3 RY1-a1-?bat1 RY1-α3-?bat1 RY1-a1-?bat1?bat2

工业用黄酒酵母二倍体

MATa，工业用黄酒酵母单倍体菌株

天津市工业微生物重点实验室 天津市工业微生物重点实验室

背景介绍

来源

MATα，工业用黄酒酵母单倍体菌株 天津市工业微生物重点实验室 MATa ?bat2 MATα ?bat2

MATa/MATα ?hom2::kan MATa/MATα ?hom2

MATa/MATα ?hom2/?hom2::kan MATa ?bat1::kan MATα ?bat1::kan MATa ?bat2?bat1::kan

天津市工业微生物重点实验室 天津市工业微生物重点实验室 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究

RY1-α3-?bat1?bat2 MATα ?bat2?bat1::kan 质粒（Plasmids） pUC19 pUG6 p-GAPza pUC-BABK pUC-HABK pUC-HB1A1K

Ampr，克隆载体 携带KanMX抗性基因 携带Zeocin抗性基因

Ampr，敲除BAT1基因的重组质粒 Ampr，敲除HOM2基因的重组质粒 Ampr，敲除HOM2基因的重组质粒

天津市工业微生物重点实验室 天津市工业微生物重点实验室 天津市工业微生物重点实验室 本研究 本研究 本研究

2.1.4 主要培养基

（1）LB培养基（w/v）

胰蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母浸粉0.5%，蒸馏水配制，pH 7.0，115℃、0.1MPa灭菌20 min。

（2）YEPD培养基（w/v）

葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸馏水配制，pH自然，121℃、0.1MPa灭菌20 min。

（3）半乳糖诱导培养基

半乳糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸馏水配制，pH自然，121℃、0.1MPa

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2 材料与方法

灭菌20 min。

（4）麦汁培养基

称取一定量粉碎的麦芽，按1：5的料水比于65℃水浴锅中糖化3-4 h至碘检完毕，然后经过过滤、煮沸、过滤，并用糖度计调整外观糖度至13°Brix，115℃、0.1MPa灭菌15 min。

（5）黄酒发酵培养基

500 mL三角瓶中加入100 g大米（蒸熟并摊凉），10 g麦曲，45 mL米浆水（PH 4.5），60 mL清水，30 mL二级种子液。

以上前四种培养基的固体培养基需再加2%的琼脂。

2.1.5 主要溶液

（1）葡萄糖标准溶液

准确称取经过105℃干燥至恒重的无水葡萄糖1.0000 g，然后用蒸馏水溶解，再加入5 mL的浓盐酸，最终用蒸馏水定容至1 L。

（2）斐林甲液

分别称取15 g五水硫酸铜，0.05 g次甲基蓝，用蒸馏水溶解并最终定容至1 L。 （3）斐林乙液

分别称取50 g酒石酸钾钠，54 g氢氧化钠，以及4 g亚铁氰化钾，用蒸馏水溶解并最终定容至1 L。

（4）100 mg/mL氨苄青霉素溶液

称取10 g氨苄青霉素，用蒸馏水溶解并最终定容至100 mL，然后用0.22 μm滤膜过滤除菌，最后用已经过灭菌的1.5 mL EP管分装, -20℃保存。

（5）G418 溶液

称取10 g G418，用蒸馏水溶解并最终定容至100 mL，得到浓度为100 mg/mL的母液，然后用0.22 μm滤膜过滤除菌，最后用已经过灭菌的1.5 mL EP管分装, -20℃保存。

（6）酚氯仿溶液

按照25：24：1的体积比分别量取Tris饱和酚、氯仿、异戊醇，然后混合均匀，存放于棕色瓶内，并4℃保存。

（7）50×TAE缓冲液

分别取242 gTris，57.1 mL冰醋酸，和100 mL 浓度为0.5 mol/L的Na2EDTA（pH 8.0），然后用蒸馏水溶解并最终定容至1 L。

（8）1 mol/L醋酸锂

称取10.201 g醋酸锂，然后用蒸馏水定容至100 mL，最后再过滤除菌。 （9）PEG3350（50％，w/v）

称取25 g PEG3350，然后用蒸馏水定容至50 mL，115℃灭菌15 min。

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（10）60%乙醇溶液

量取60 mL色谱纯的无水乙醇，然后用去离子水定容至100 mL。 （11）20%乙醇溶液

量取20 mL色谱纯的无水乙醇，然后用去离子水定容至100 mL。 （12）高级醇混标溶液

分别准确量取色谱纯的正丙醇、异丁醇和异戊醇0.2 mL、0.3 mL 和0.5 mL，然后用浓度为60%的乙醇溶液定容至10 mL，得到高级醇的混标母液，4℃冷藏。

（13）1.6%内标液

准确量取色谱纯的乙酸正戊酯0.16 mL，然后用浓度为60%的乙醇溶液定容至10 mL得到1.6%（V/V）的内标液，4℃冷藏。

2.2 分析方法 2.2.1 CO2失重的测定

黄酒发酵时，用带有针孔的橡皮塞塞紧瓶口，置于30℃条件下静置发酵，在黄酒发酵过程中每隔12 h称重一次，称重前充分晃动三角瓶中的发酵液以尽可能赶走瓶中CO2, 当发酵失重小于1 g/12 h时，表明黄酒发酵已经基本结束。

2.2.2 酒精度的测定

利用酒精计比重法测定酒精度[74]。

用100 mL的量筒量取100 mL发酵液于1000 mL的蒸馏瓶中，然后加入100 mL蒸馏水，再加入适量的消泡剂，摇匀，接入蒸馏装置，并用100 mL量筒作为接收器收集蒸馏液。同时为了防止酒精挥发，在蒸馏过程中应使量筒始终处于冰浴中。当量筒中蒸馏液滴至98 mL左右时停止蒸馏，然后再用蒸馏水补足至100 mL即可。蒸馏结束后用酒精计测定蒸馏液酒精度，同时用温度计测量蒸馏液的温度，最后将该温度下测定的酒精度换算成20℃条件下的酒精度。

2.2.3 还原糖的测定[75]

利用斐林试剂法测定发酵液中还原糖的含量。 （1）原理

以次甲基蓝作为指示剂，用试液滴定煮沸着的斐林试剂，终点时微过量糖液会将蓝色的指示剂次甲基蓝还原成无色的还原态，最后根据试液的用量可以求得还原糖的含量。

（2）斐林试剂的标定

分别吸取斐林试剂甲液和乙液各5 mL，并置于150 mL三角瓶中，然后准确地加入10 mL空白液（蒸馏水），预先用滴定管向三角瓶中加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，以保证后面滴定时所消耗的0.1%标准葡萄糖溶液是在1 mL以内，摇匀。在电炉上加热至沸腾，然后立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定直至蓝色消失，此滴定操作过程要求操

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2 材料与方法

作准确并且迅速，需要在1 min以内完成，滴定完成后准确记下滴定用0.1%标准葡萄糖溶液的体积。

（3）测定

吸取斐林甲液、乙溶液各5 mL于150 mL的三角瓶中，然后加入1mL经过适当稀释的样品稀释液以及9 mL蒸馏水，其余操作过程同上。

（4）计算

式中：Vo—空白液所消耗的标准葡萄糖溶液的体积（mL）；

V—样品稀释液所消耗的标准葡萄糖溶液的体积（mL）； C—标准葡萄糖溶液的浓度（g/L） n—样品的稀释倍数

Vs—所取样品稀释液的体积（mL）

2.2.4 挥发性风味物质含量的测定

采用气相色谱法[75-77]测定黄酒发酵液的蒸馏液中高级醇含量，采用的是内标法，乙酸正戊酯作为内标。

（1）色谱条件

气相色谱仪为Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自动进样器，色谱柱为 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 30 m×320 μm×0.5 μm ，检测器为FID。进样口的温度为 220℃，检测器的温度为250℃。进样量条件：1 μL的进样量，并设置为20：1的分流比。载气条件：载气为高纯氮，并将其流速设置为2 mL/min。升温程序：起始柱温设置为50℃，并以5℃ /min的升温速度上升至80℃，然后再以10℃/min升温升至150℃。

（2）样品预处理

取内标液0.1 mL至10 mL容量瓶中，并用发酵液蒸馏所得酒样定容，混匀后，取1.5 mL加入到自动进样瓶中，然后进行气相分析。

（3）分析方法

保留时间法为气相色谱定性鉴定中最常用的分析方法，在一定的色谱条件下，各物质的出峰时间保持不变。先进样需要检测的标准品溶液，可测得各物质的保留时间。然后再进酒样进行检测，就可以根据各物质的保留时间初步定性酒样中需要检测的各物质。根据各物质的峰面积用内标法进一步定量计算各物质的含量。

2.2.5 生长曲线的测定

（1）取斜面菌种一环接种到装有5 mL YEPD液体培养基的试管中，30℃条件下静置培养12 h。

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（2）用全自动生长曲线分析仪测定菌株的生长曲线：接种量为2%～5%梯度接种，培养温度为30℃，600 nm紫外光下测定吸光值，每隔1 h测定一次菌液的OD值。

（3）以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

2.3 实验方法 2.3.1 引物设计

本实验中所用全部引物序列见表2-4。

（1）BAT1基因单敲除突变株及BAT1、BAT2基因双敲除突变株的构建及验证所需引物

根据GenBank报道的BAT1基因序列设计一对引物BAT1-U和BAT1-D，用于验证黄酒酵母基因组中BAT1基因的存在。在BAT1基因外部的上下游分别设计一对引物BA-U和BA-D及BB-U和BB-D，分别扩增BAT1基因两侧非编码区的片段BA和BB，用于同源重组敲除BAT1基因。根据质粒pUG6序列设计一对引物K-U和K-D扩增KanMX基因，作为抗性筛选标记。在BA片段的上游设计引物B-S和在KanMX序列内部设计引物K-S-BAT1用于BAT1基因单敲除突变株的上游验证，在KanMX基因内部设计引物K-X-BAT1和在BB片段的下游设计引物B-X用于BAT1基因单敲除突变株的下游验证。BAT1、BAT2基因双敲除突变株的验证和BAT1基因单敲除突变株的验证相同。

（2）HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1的构建及验证所需引物 根据GenBank报道的HOM2基因序列设计一对引物HOM2-U和HOM2-D，用于验证黄酒酵母基因组中HOM2基因的存在。在HOM2基因外部的上下游分别设计一对引物HA-U和HA-D及HB-U和HB-D，分别扩增HOM2基因两侧非编码区的片段HA和HB，用于同源重组敲除HOM2基因。在HA片段的上游设计引物H-S和在KanMX序列内部设计引物K-S-1用于HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的上游验证，在KanMX基因内部设计引物K-X-1和在HB片段的下游设计引物H-X用于HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的下游验证。

（3）HOM2基因两个等位基因敲除的突变株RY1-3的构建及验证所需引物 在HOM2基因保守区的两端分别设计一对引物HA1-U和HA1-D及HB1-U和HB1-D，分别扩增HOM2基因的部分片段（分别命名为HA1片段和HB1片段），用于同源重组中断HOM2基因。在HA1片段的上游设计引物H-S和在KanMX序列内部设计引物K-S-2用于HOM2基因两个等位基因敲除的突变株的上游验证，在KanMX基因内部设计引物K-X-2和在HB1片段的下游设计引物H-X用于HOM2基因两个等位基因敲除的突变株的下游验证。

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