发酵工程毕业论文完成版 - 图文(10)

3 结果与讨论

3.3.3 HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的获得及验证

3.3.3.1 重组片段的获得

以构建好的重组质粒pUC-HABK为模板，利用引物HA-U和HB-D扩增2517 bp的重组片段HA-KanMX-HB，电泳检测目的片段，结果如图3-14。结果显示PCR扩增产物单一，特异性条带大小正确。

图3-14重组片段HA-KanMX-HB的PCR产物 Fig.3-14 PCR recombinant fragment HA-KanMX-HB M：DL5000 DNA Marker；1：HA-KanMX-HB

3.3.3.2 突变株的获得及验证

通过醋酸锂转化法将重组片段HA-KanMX-HB导入黄酒酵母二倍体菌株RY1中，通过HA片段和HB片段与酵母染色体上HOM2基因两侧的同源序列同时发生同源重组，从而整合到酵母染色体上并随其一起复制，通过同源重组过程实现了HOM2基因被KanMX基因完全替换，从而实现HOM2基因的敲除。

挑取G418平板上长出的转化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液体培养基中培养，并提取其基因组，然后以此基因组DNA作为模板，进行PCR验证。利用引物H-S和K-S-1可从转化子中扩增出大小为1577 bp的上游验证产物（图3-15，泳道2），利用引物K-X-1和H-X可从转化子中扩增出大小为1272 bp的下游验证产物（图3-15，泳道4），而出发菌株则无扩增产物(图3-15，泳道1和3)，PCR扩增出的产物大小与预期相同，此结果说明基因片段HA-KanMX-HB已经成功整合到黄酒酵母染色体HOM2基因位点上，替代敲除了HOM2基因，即HOM2基因一个等位基因敲除的突

变株构建成功，命名为RY1-1。

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图3-15 突变株RY1-1的PCR验证 Fig.3-15 PCR confirmation of mutants RY1-1

M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1的基因组为模板，以H-S和K-S-1为引物进行PCR扩增的产物；2：以RY1-1的基因组为模板，以H-S和K-S-1为引物进行PCR扩增的产物；3：以RY1的基因组为模板，以H-X和K-X-1为引物进行PCR扩增的产物；4：以RY1-1的基因组为模板，

以H-X和K-X-1为引物进行PCR扩增的产物

3.3.4 HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响

3.3.4.1 突变株RY1-1与出发菌株RY1基本发酵性能的比较

将构建好的HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1与出发菌株RY1同时进行黄酒发酵实验，发酵过程中记录CO2失重、发酵结束后测量发酵液中的还原糖含量，蒸馏黄酒发酵液并测量其酒精含量，结果见表3-5所示。

表3-5 突变株与出发菌株基本发酵性能的比较

Table 3-5 Basic fermentation performances of mutant strain and parent strain 菌株

CO2累计失重

（g）

RY1 RY1-1

29.9 30.1

酒度 （%，v/v）

14.0 14.0

残糖 （g/100 mL）

0.97 0.93

由表中可以看出，HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1的CO2累计为30.1 g，发酵液蒸馏后酒度为14.0度，结果均与出发菌株RY1接近，同时残糖量也都低于1 g/100mL，说明HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1与出发菌株RY1发酵均很彻底。与出发菌株发酵结果对比表明，HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母二倍体菌株基本发酵性能无明显影响。

3.3.4.2 突变株RY1-1与出发菌株RY1高级醇生成量的比较

HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1与出发菌株RY1黄酒发酵结束后，取发酵液的蒸馏液进行气相色谱分析，检测突变株与出发菌株发酵产高级醇的含量，

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3 结果与讨论

结果见表3-6。

表3-6 突变株与出发菌株高级醇生成量的比较

Table 3-6 Higher alcohols production of mutant strain and parent strain 菌株

正丙醇 （mg/L）

RY1 RY1-1

99.71 101.79

异丁醇 （mg/L） 158.16 145.63

异戊醇 （mg/L） 357.06 248.54

从表中可以看出，出发菌株RY1产正丙醇、异丁醇和异戊醇的含量分别为99.71 mg/L、158.16 mg/L和357.06 mg/L，HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别为101.79 mg/L、145.63 mg/L和248.54 mg/L，与出发菌株RY1相比，突变株RY1-1生成的正丙醇含量没有明显变化，异丁醇含量降低了7.90%，异戊醇含量降低30.39%。结果说明，HOM2基因一个等位基因敲除能够显著降低黄酒酵母二倍体菌株生成异戊醇的含量，对正丙醇的生成量几乎没有影响，对异丁醇的生成量影响也不太明显。

3.3.5 遗传标记基因KanMX的去除

为后续研究中还要在突变株RY1-1的基础上再次敲除HOM2基因，需要删除突变株RY1-1的KanMX抗性基因。本研究采用Cre/LoxP报告基因挽救系统剔除KanMX遗传标记基因。

Cre/LoxP系统[83]是由Cre重组酶及其识别序列LoxP位点组成。通过在靶序列引入标记基因和两侧的LoxP位点，以Cre酶位点发生特异性重组，从而实现靶基因结构部分或者全部被破坏，使其不能正确表达产物。pUG6质粒中KanMX遗传标记基因的两端有两个LoxP位点，pGAPza质粒中含有Cre重组酶基因，能够将两个LoxP位点之间的DNA序列切除，这样在原位点上就只留下一个LoxP位点，突变株由于丢失KanMX遗传标记基因而丧失了抗性标记功能。 3.3.5.1 KanMX基因的去除

利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒导入黄酒酵母突变株RY1-1中，并用Zeocin抗性平板筛选转化子。将携带有pGAPza质粒的转化子在半乳糖培养基中诱导表达5 h左右，梯度稀释后取适量菌液涂布于YEPD平板，待长出单菌落后，对应点种到无G418的YEPD平板和含有600 μg/mL G418的YEPD平板上，30℃培养2～4 d。如图3-16所示，在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的单菌落就是Kan抗性基因丢失了的酵母转化子。

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(a) (b)

图3-16 G418抗性基因丢失菌株的点种反选 Fig.3-16 Counter selection for mutants with KanMX losing (a)：YEPD平板；(b)：G418(600 μg/mL)抗性YEPD平板

3.3.5.2 KanMX基因去除突变株的PCR验证

随机筛选在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的酵母突变株，命名为RY1-2。提取突变株RY1-1和RY1-2的基因组，并以此基因组为模板，利用引物Kan-U和Kan-D进行PCR扩增，突变株RY1-1和RY1-2应分别扩增出1610 bp与100 bp左右大小片段。经琼脂糖凝胶电泳（图3-17，泳道1和2）与预期大小一致，进一步证明突变株RY1-2基因组上的KanMX抗性基因已被成功剔除。

图3-17 KanMX基因丢失PCR验证 Fig.3-17 PCR identification for KanMX losing M： DL5000 DNA Marker；2：RY1-1；3：RY1-2

为了保证突变株RY1-2的遗传稳定性，需丢失其导入的pGAPza质粒。将突变株RY1-2于YEPD液体培养基中传代培养，传代十次后，选取RY1-2第一代及第十代提

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3 结果与讨论

取酵母质粒，然后以提取的酵母质粒作为模板，利用引物Zeocin-up与Zeocin-down进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失。由图3-18可知从第一代RY1-2酵母质粒上可扩增出1200 bp左右大小的Zeocin抗性基因片段，而从第十代RY1-2酵母质粒上则扩增不出，证明RY1-2突变株中的pGAPza质粒已丢失。

图3-18 pGAPza质粒丢失PCR验证 Fig.3-18 PCR identification for pGAPza losing M：DL5000 DNA Marker；2：第一代； 3：第十代

经黄酒发酵验证，突变株RY1-2的基本发酵性能和产高级醇含量与突变株RY1-1相比基本保持不变。

3.3.6 小结与讨论

将HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1与出发菌株RY1进行黄酒发酵实验，发酵结果表明，与出发菌株相比，突变株RY1-1的基本发酵性能无明显变化，保持了黄酒酵母快速发酵的优良发酵特性。同时气相色谱检测结果显示，HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1黄酒发酵所产生的异戊醇含量出现了明显的下降。突变株RY1-1去除KanMX抗性基因后，得到的突变株RY1-2的基本发酵性能和产高级醇含量与RY1-1相比基本保持不变。HOM2基因的敲除能够显著降低异戊醇的生成量这一实验结果与Styger[71]等人的研究结果相同。HOM2基因编码的天冬氨酸β-半醛脱氢酶是苏氨酸和蛋氨酸生物合成途径中的关键酶，但de Robichond-Szulmajster[84]等人曾于1965年指出天冬氨酸β-半醛脱氢酶在Ehrlich代谢途径最后一步反应中能够起到直接的作用，是高级醇代谢途径中的重要酶。

3.4 HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 3.4.1 重组质粒pUC-HB1A1K的构建

3.4.1.1 目的片段的扩增

为了提高同源重组效率，缩进设计同源臂，以HOM2基因的一部分（分别命名为HA1片段和HB1片段）作为同源臂。以黄酒酵母RY1基因组为模板，利用一对引物

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