植物生理生化实验(3)

实验五 叶绿素含量测定 P134

原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

如果溶液中友树种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。 A665=K1Ca+K2Cb ； Ca=13.95A665-6.88A649 A649=K2Cb+K1Ca ； Cb=24.96A649-7.32A665 CT＝Ca＋Cb

CXC=（1000A470-2.05Ca-114Cb）/245

材料：玉米叶片（完全、缺Ca）

操作步骤：取鲜叶剪碎、混匀。各取0.1g分成2组，放入研钵中研磨成匀浆，加入95%乙醇10ml，继续研磨，静置3-5min。将液体过滤至25ml棕色容量瓶中。定容，摇匀。 以95%乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。 处理 完全 缺Ca 光密度 649nm 0.341 0.346 665nm 0.817 0.608 470nm 0.751 0.575 叶绿素含量mg/g FW Chla 2.263 1.534 Chlb 0.633 0.915 Chl 2.896 2.449 Chla/Chlb 3.576 1.677 类胡萝卜素 Mg/g FW 0.453 0.148 叶绿体色素含量（mg/g鲜重）=CV/W*1000 ；V=0.025 ；W*1000=0.1

注意事项：

1. 剪碎叶子时要去中脉； 2. 加入CaCO3要少量；

3. 过滤后再用少量95%乙醇冲洗研钵及残渣数次，最后连残渣一起倒入漏斗；残渣、滤纸要充分洗脱； 4. 研磨要到绿色褪去、组织变白为止； 5. 比色液不能浑浊。

思考题：

1. 叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？ 不能，蓝光区也有类胡萝卜素的吸收峰，会干扰。

2. 为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜材料可以用无水丙酮提取？

因为叶绿素“头部”亲水，新鲜材料中含有水分，用无水丙酮照样可以提取，而干材料中不含水，需要80%丙酮才可提取。

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实验六 氮蓝四唑法测定超验物歧化酶活力 P172

原理：超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基O 的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 。O 与H+反应生成H2O2，H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。另一部分O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收峰。而SOD可清除O ，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶活性越低，反之酶活性越高。据此可以计算出酶活性大小。

材料：玉米叶片（完全、缺Ca）

操作步骤：分别取0.2g叶片于研钵中，加入2ml冰冷的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，再加入3ml冰冷磷酸缓冲液。取1ml于4800r/min下离心10min。将上清液倒入青霉素瓶中，即为SOD粗提液。按如下操作： 取6支干燥的、玻璃质地一直的普通试管 试管编号 酶液 ul 提取介质（磷酸缓冲液）ul SOD反应混合液（含核黄素）ml 各管充分摇匀 560nm吸光值 1 参比 100 4 2 对照 100 4 100 4 3 正常叶片 100 4 100 4 4 5 缺钙叶片 100 4 6 放暗处 0 0.393 置于光强3000Lx照光15min 0.313 0.366 0.292 0.190 SOD总活性(U/g鲜重)=（ACK-AE）V/0.5ACKWVT ；V=5； W=0.2； VT= 0.1

注意事项：

1. 所用试管的玻璃质量要一样，包括厚度、直径等； 2. 照光条件要一致，照光时试管的高度、背景等； 3. 要多做对照消除日光灯管的光质差异；

4. 植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮消除； 5. 结果计算时要用相邻对照管代入公式。

思考题：

1. 在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管？ 暗对照管是用来调零，以消除自身颜色的干扰。 光对照管是用来作为标准，与其他试管进行比较。

2. 影响本实验准确性的因素是什么？应如何克服？

应该控制好光源和光照强度。尽量使每支试管与光源的距离一致，并且每支试管高度、背景等要一致。试管规格也要一致。

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实验七 改良半叶法测定植物光合速率

原理：植物进行光合作用形成有机物，而有机物的积累可使叶片单位面积的干物重增加，但是，叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输导组织讲同化产物运出，从而使测得的干重积累值偏低。为了消除这一偏差，必须将待测叶片的一半遮黑，测量相同时间内叶片被遮黑一侧的单位面积干重的减少值，作为同化产物输出量。

“改良半叶法”采用烫伤、环割或化学试剂处理等方法来损伤叶柄韧皮部活细胞，以防止光合产物从叶片中输出。 材料：茶叶

操作步骤：在晴天上午7-8点开始，选10片对称性良好、向阳、厚薄一致的完整功能叶。挂牌编号。 用刀片在叶柄基部环割，去掉韧皮部，再用锡纸包绕使叶片保持原来着生角度。并用刀片割下一半叶片（不可割到主脉），割下的叶片包裹于透气良好的湿布中。记录时间。

4-5h后再割下另一半叶片。与原先割下的半叶一一对应，重叠，用模板切下同样大小的叶面积，将光照和暗处理分别放在105℃下杀青10min，然后在80℃下烘至恒重，在分析天平上称重并计算结果。 植物材料：茶叶 取样面积（cm2）：9*2*3=54 光照叶的干重（mg）：340 第一次取样时间：9:00 光合作用时间（h）：8 暗处理叶的干重（mg）：327 第二次取样时间：17:00 干重增量（光-暗）（mg）：13 光合速率（mg/dm2h）=[(光-暗)干重增量]/[叶片切块面积*光合时间]=0.03

注意事项：

1. 实验要选择晴天做，所用叶片要选择对称性好、厚薄一致、向阳、无病虫的功能叶。 2. 韧皮部要切割彻底，如果切割不彻底，部分有机物仍可外运，测定结果偏低。 3. 切割韧皮时，不要伤及木质部。

4.光照结束后，相同编号的两半叶要对应部位叠在一起，用适当大小的模板切割相同的叶片面积。 思考题：

1. 简要介绍测定光合速率的三种方法及原理。 改良半叶法：。。。 氧电极法：植物进行光合作用放出氧气，可以用薄膜氧电极进行测定，它具有灵敏度高，操作

简便，可以连续测定水溶液中溶解氧含量及其变化过程。

便携式光合测定仪法：ECA型光合测定仪是利用先进的单片机技术对相应的CO2浓度、湿度、温度和光合有效辐射（PAR）等传感器，进行信号采集，经模数（A/D）转换处理获得数据。可显示光合速率（Pn），蒸腾速率（Tr），水分利用效率（WUE）和气孔阻抗（SR）等，其最大优点是可以进行活体测定，多数据测定，还便于携带，进行野外测量。

2. 测定光合速率为什么要选择对称性好、叶龄、叶色、受光一致，无病虫害的功能叶？

同一叶片中脉两侧，其内部结构、生理功能基本一致。幼叶、老叶、枯叶、光照不足等因素均会影响叶片的光合速率，对结果造成误差。

3. 在改良半叶法中为什么将待测叶片编号？为什么要切割韧皮部？

编号是为了在光合作用后，光照叶片能与另一半暗处理叶片一一对应。才能在根据模板切割时，取的是相应位置，因为叶片是对称的，因此取对称位置认为叶片生理状况也是一致的。

韧皮部是运输养分的部位，叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输导组织讲同化产物运出，从而使测得的干重积累值偏低。因此要切割韧皮部让养分无法输出。

4. 改良半叶测定光合速率受哪些因素的影响？

叶片的对称性、叶龄、叶色、受光、水分、韧皮部的环割等。

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