植物生理生化实验

实验一 植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199

原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 ①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。

②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：

分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100ml。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作 试管编号 试剂 样品提取液ml 无氨蒸馏水ml 0.1抗坏血酸ml 水合茚三酮ml 570nmOD值 每管含氮量 0 0 空白1 0 2.0 0.1 3 0.130 1.26 样品1（未萌发） 2 2 0 0.1 3 0.123 1.19 3 2 0 0.1 3 0.188 1．83 样品2（萌发） 4 2 0 0.1 3 0.168 1.83 5 2 0 0.1 3 置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm波长下测定吸光度。 样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CVT/VSW *100 ；C=A/k (k=0.103) ； VT=100/2 ； VS=1 ； W=1

注意事项：

1. 测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水； 2. 样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；

3. 抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；

4. 水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于

90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇； 5. 稀释后要迅速比色；

6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量； 7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。

思考题：

1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？

不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。 2. 测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？

可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。 3. 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？ 因为植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。 10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。 4. 抗坏血酸在测定中的作用是什么？

作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。

722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%。②吸光度模式

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实验二 植物组织可溶性蛋白质含量测定—Folin酚试剂法 P188

原理：Folin酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。 ①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物。

②络合物和蛋白质中氨基酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质。

在一定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在650nm，因此可用分光光度法测定其含量。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：

分别取0.5g萌发、未萌发水稻于研钵中+2ml蒸馏水+石英砂，充分研磨，+3ml蒸馏水，定容25ml，放置15min，过滤取上清液备用。如下操作 编号 牛血清蛋白250ug/ml 蒸馏水ml 试剂甲ml 试剂乙ml 1 0 1．0 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 5 摇匀→室温下放置10min 0.5 迅速摇匀→室温放置30min 650nmOD值 蛋白质含量 0.000 0 0.112 50 0.154 100 0.255 150 0.474 200 0.551 250 0.167 71.8 0.237 104.8 6 1.0 0 未萌发 酶0.5 0.5 萌发 酶0.5 0.5 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=XVTN/WVS *1000 ；VT=25；W=0.5；VS =0.5

注意事项：

1. Folin酚试剂只有在酸性条件下才稳定； 2. 试剂甲、试剂乙加入后需要迅速摇匀； 3. 反应最适温度在25-30℃；

4. 样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基类化合物均会产生干扰。

思考题：

1. 请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并比较其优缺点。

①Folin-酚试剂法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰 ②考马斯亮蓝G-250法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：易造成二次污染 ③紫外分光光度法 优点：节约样品、操作简单 缺点：准确度差

2. 测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举例说明。 可以测定植物的代谢水平、食品中的营养指标。

3. Folin-酚试剂法测定可溶性蛋白的原理是什么？测定中应注意什么问题？ 原理。。。

测定时要注意最适温度为25-30℃，Folin-酚试剂只有在酸性条件下才稳定，并会受到柠檬酸等化合物的干扰。

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实验三 植物组织Vc含量测定—滴定法 P268

原理：Vc具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当用蓝色碱性2,6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型。但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，则再滴加2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色，借此可指示滴定终点。根据滴定消耗的2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可计算出被测样品中抗坏血酸的含量。

材料：白萝卜

操作步骤：5g白萝卜于研钵中，加入少量2%草酸和石英砂，快速研磨成匀浆，用2%草酸洗入100ml容量瓶中并定容，过滤，滤液备用。以2,6-二氯酚靛酚溶液滴定呈粉红色，并在15s内不褪色为终点。 试剂 2%草酸 标准VC(20ug/ml) 样品提取液ml 2,6-二氯酚靛酚燃料滴定ml 1空白 10 0 0 0.15 Y1 2染料标定ml 3染料标定ml 0 10 0 2.78V1 0 10 0 2.75V1 4样品ml 0 0 10 0.98Y0 5样品ml 0 0 10 1.02Y0 样品VC含量（mg/100g鲜重）=（YO-Y1）A/W *VT/VS *100 ； A=10ml*20/V1-Y1 *10-3 VT=100 ； VS=10 ；W=5

注意事项：

1. VC很容易被还原，研磨要快速，滴定也应控制在2min以内； 2. 2,6-二氯酚靛酚很不稳定，每次实验时需重新测定浓度； 3. 若样品溶液有较多泡沫，可适当加丁醇

思考题：

1. 为什么在测定VC的同时要进行2,6-二氯酚靛酚溶液的标定？

2,6-二氯酚靛酚溶液很不稳定。

2. 为了保证抗坏血酸含量准确测定，操作过程应注意些什么？

VC很容易被还原，需要快速研磨、快速匀浆、快速滴定，并要避免阳光直射，避免用铜、铁器具接触白萝卜。并用2%草酸抑制酶活性，避免VC分解。

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实验四 植物硝酸还原酶活性的测定—活体法 P126

原理：NR催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生产红色偶氮化合物。在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。NR活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

材料：甘薯叶片

操作步骤：取2张不同的甘薯叶片，洗净后吸干水分，打孔后混匀，迅速取0.3-0.4g样品3份于三角瓶中。

30%三氯乙酸ml KNO3（磷酸缓冲液）ml 1（对照） 1 9 2（样品1） 0 9 3（样品2） 0 9 真空干燥箱抽气10min→叶片下沉 恒温培养箱30℃暗处30min→酶促反应 30%三氯乙酸ml 540nmOD值 0 0 1 0.031 1 0.030 3份各取1ml于试管+2ml 1%磺胺+2ml 0.02%萘基乙烯胺，摇匀，显色15min，以1号管作参比，在540nm下比色。

样品中硝酸还原酶活性[ug/(g.h)鲜重]=（X/VS）VT/WT X=OD值/k k=0.307；VS=1；VT=10ml；W=0.32；T=0.5h

注意事项：

1. 硝酸还原酶易失活，操作应迅速；

2. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨，并严格控制反应时间； 3. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。

4. 取样宜在晴天进行，最好提前一天施用一定量的硝态氮肥，取样部位要一致。

思考题：

1. 测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用一定量的硝态氮肥，并且取样应在晴天进行？

硝态氮肥即硝酸盐，硝酸还原酶是诱导酶，硝酸盐诱导硝酸还原酶的合成，为实验提供足量的酶。 晴天植物进行光合作用，积累足够的NADH和碳水化合物（能量）提供反应。

2. 测定硝酸还原酶活性的离体法和活体法各有何特点？

活体法：步骤简单，适合快速、多组测定。本实验不需外加NADH。但重复性不好，受生物本身性质影响。

离体法：步骤复杂，但重复性较好，反应条件受人为控制。研磨易使酶失活，NADH在空气中易被破坏，要外加NADH。

3. 酶的诱导为什么要在暗处进行？

亚硝酸盐在光照下易分解，叶绿素光合作用产生的一些辅酶会加快亚硝酸盐分解。

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实验五 淀粉酶活性的测定 P174

原理：淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α-淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶不耐酸，在PH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃保温15min则被钝化。 本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α+β）比较，即可求出β-淀粉酶的活力。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

操作步骤：各取1g种子，低温置于研钵中+少量石英砂+2ml蒸馏水，研磨成匀浆，过滤后于100ml容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶原液（酶液1）。取原液10ml于50ml容量瓶，用蒸馏水定容，即为淀粉酶稀释液（酶液2）。如下操作 酶液1 ml 钝化β-淀粉酶 酶液2 ml 3,5-二硝基水杨酸ml 预保温 1%淀粉溶液ml 40℃ 保温 3,5-二硝基水杨酸ml 0 1 0 2 1-1 1 1-2 1 0 0 1 2 2-1 0 1 2 1 0 2-2 0 1 0 1 2 置70℃水浴中15min，取出后在流水中冷却 40℃恒温水浴中保温10min 40℃恒温水浴中保温5min（酶促反应） 摇匀，置沸水浴10min，取出后冷却，加蒸馏水至20ml。在540nm波长下比色。

试管编号 项目 540nmOD值 测定α-淀粉酶 未萌发 A对 0.188 A测 0.166 萌发 B对 0.207 B测 0.255 C对 0.103 测定（α+β）-淀粉酶 未萌发 C测 0.107 萌发 D对 0.108 D测 0.160 参 比 管 0 α-淀粉酶活力[麦芽糖mg/(g.min)鲜重]=XVT/WVST ； X=OD测-OD对/0.2273 （α+β）-淀粉酶总活力[麦芽糖mg/(g.min)鲜重]=XVTN/WVST ；VT=100；W=1；VS=2；T=5；N=5

注意事项：

1. 要在低温下研磨，以免研磨产生的热破坏酶；

2. 水浴温度要严格控制，水浴、显色时间要严格控制； 3. 水浴锅内水位要高于试管水位。

思考题：

1. 本实验在测定α-淀粉酶活性及（α+β）-淀粉酶总活性的过程中，1号试管和2号试管有什么不同？

为什么每一组都要设置对照管？

1号管和2号管所加入的3,5-二硝基水杨酸的顺序不同，3,5-二硝基水杨酸的作用是终止酶促反应； 每一组都设置对照组是为了排除种子本身所含淀粉酶对实验的干扰。

2. 测定淀粉酶活性时，为什么要用PH5.6的柠檬酸缓冲液来配置1%淀粉溶液？为什么1%淀粉溶液要在

40℃进行保温？

为了让反应在最适PH下进行； 为了让反应在最适温度中进行。

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