植物生理生化实验(2)

实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶—垂直板法 P180

原理：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生不同的泳动速率而相互分离。利用特异性的显色反应使待测酶蛋白染色后，就可在凝胶中呈现电泳酶谱。

过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种类及活性的调节。利用过氧化物酶催化H2O2分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物同工酶酶谱。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

操作步骤：安装→制分离胶（分离胶缓冲液PH8.9 3ml、分离胶贮液6ml、H2O 2ml、过硫酸铵溶液12ml）→灌注（胶面加0.5cm水层，静置20min至水层底下有一清晰界面，倒去水层用滤纸吸干）→制浓缩胶（浓缩胶缓冲液PH6.7 0.5ml、浓缩胶贮备液1ml、H2O 1ml、过硫酸铵溶液2ml）→灌注（用水封液面，放样品梳，静置10min，凝固后取出样品梳，用滤纸吸水）→上样（离心后1ml样品提取液+20%蔗糖至胶的凹槽）→电泳（电极上、下加电极缓冲液，上槽1滴溴酚蓝，恒压100-120V、120-140V，当溴酚蓝达距管底0.5cm处时切断电源）→剥胶→染色（0.5ml联苯胺母液+9.3ml H2O+0.2ml3%H2O2，混匀倒入盛凝胶的培养皿，10min后用水冲洗）

注意事项：

1. 玻璃要干燥并夹好；

2. 凝胶配置好要马上灌胶，过硫酸铵要现配现用，染料要现配现用； 3. 针头推出胶液时，针头慢慢向上移动，直至刻度线处； 4. 附着在研钵壁上的研磨样品要洗下并全部转入离心管； 5. 电极缓冲液慢慢加入每支试管直至浸没顶部为止； 6. 电泳时要控制电流，不可超过170V；

7. 剥胶时，长针头注射器吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢将注射器中的溶液推出，并不断转动凝

胶管。

思考题：

1. 简述试验中过硫酸铵、四甲基乙二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用？ 过硫酸铵：催化剂，提供过硫酸铵自由基；

四甲基乙二胺：加速剂，加速过硫酸铵形成自由基；

蔗糖：粘性好，不易扩散，能使样品在样品槽里不易散开；

溴酚蓝：指示剂，电泳时比蛋白质快，从而得知反应进行的程度； H2O2：过氧化同工酶底物。

2. 试比较垂直板型和圆盘凝胶电泳的优缺点。

垂直板型凝胶电泳法： 优点：可同时点样，使结果直观化。 缺点：易漏胶，使实验失败。 圆盘式凝胶电泳法： 优点：不易漏胶。 缺点：不能同时点样，染色后不易比较结果。

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实验一 植物抗逆性的测定—电导仪法 P282

原理：植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物收到逆境影响时，如高温或低温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞浸液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗逆性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。

材料：桂花叶片（正常、高温50℃/低温-20℃）

操作步骤：将玻璃仪器及桂花叶片用去离子水洗净、擦干。分别给叶片打孔，每种叶片打30个小叶片，每种分2组。如下操作 叶片 去离子水ml 真空抽气 水分交换 测初电导值 杀死细胞 测终电导值 相对电导度 伤害率 KA’=8.8 KB1’=36 0.092 KA=6.7 KB1=9.5 空白 15 15 15 正常叶 15 15 15 15 低温 15 15 15 15 高温 15 15 抽气10min，叶片下沉 室温静置20min，摇晃 KB2=8.7 KB2’=33.9 KC1=30.1 KC1’=62.2 KC2=30.4 KC2’=59.2 KD1=16.9 KD2=14.4 沸水浴煮10min，冷却至室温 KD1’=56.8 KD2’=53.4 0.193 11.1% 0.454 39.9% ①正常叶片相对电导率=KB-KA/KB’-KA’ ②处理叶片相对电导率=KC-KA/KC’-KA’ 膜伤害率=②-①/1-① *100%

注意事项：

1. 整个过程中，去离子水要使用同一洗瓶中的，减少误差；

2. 全部器皿要用去离子水洗净，洗净后的叶片接触的用具必须绝对洁净，也不能用手直接触碰； 3. 电导率的测定要在同一温度下，每次测定前要用去离子水清洗并用吸水纸吸干电极； 4. 使用电导仪时量程调至199.9us，若起始不为零，需要机械调零。

思考题：

1. 植物抗逆性与细胞膜透性有何关系？

在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。

2. 为什么要用真空抽气？为什么要充分振荡？

真空抽气使细胞间隙中的电解质与外界水分交换，使得细胞内、外电解质平衡。此时，测定溶液电导度即是测定植物细胞内的电导度。

充分振荡使附在叶片或附近的电解质能充分溶解在水中，减少误差。

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实验二 植物组织水势的测定--小液流法 P109

原理：将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。因溶液的浓度是已知的，可根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势（φπ），即代表植物的水势（φW）。φW=φπ=-P=-iCRT

材料：灰莉叶片

操作步骤：取叶片打小圆片50片，如下操作 编号 蔗糖溶液 蒸馏水 溶液浓度 液滴移动方向 1 0.5 9.5 0.05 ↓ 2 1 9 0.1 ↓ 3 2 8 0.2 ↑ 4 3 7 0.3 ↑ 5 4 6 0.4 ↑ 6 5 5 0.5 ↑ C=0.1+0.2/2 ；φW=φπ=-P=-iCRT

注意事项：

1. 叶片打孔要在同一部位，并避免主脉； 2. 玻璃仪器要干燥洁净；

3. 小叶片与溶液要混合均匀； 4. 甲烯蓝不能加太多； 5. 蔗糖溶液用前要摇匀；

6. 叶片打完孔，立即放入青霉素瓶并加入蔗糖； 7. 最后毛细管放液滴时要缓慢。

思考题：

1. 试述小液流法测定植物组织水势的原理？

讲植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，如果植物组织的水势小于某一溶液的水势，则组织吸水，反之失水。当到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。由于溶液浓度已知，可根据公式算出其渗透压，取负值即代表植物的水势。

2. 小液流法测定植物组织水势时为什么操作时，应强调所用试管、毛细管应保持干燥？打取小圆片并投

入到试管中时动作应迅速？加入甲烯蓝不能太多？

所用仪器若不干燥，其所含水分会影响所配溶液浓度并对实验结果造成误差； 所打小圆片要迅速投入试剂中，为的是避免小圆片失水，造成误差；

甲烯蓝若加太多，会使叶片组织水势低于该蔗糖溶液的渗透势，造成误差。

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实验三 植物的无土培养和缺素症状

原理：用植物必需的矿质元素配成营养液培养植物，可使植物长得与土壤中一样好。应用此法，所用元素的种类和用量可完全人为地加以控制。要了解某元素缺乏所引起的生理病症，可从营养液中减去该元素，以便在以后的生长过程中进行观察，观察缺素症后将所缺元素加入营养液中，缺素症状又可逐消失。

这类实验，通常用溶液培养，为了管理方便，也常将溶液加入洁净的石英砂培养植物，则称为砂基培养。

材料：玉米种子

操作步骤：选4株玉米苗，分成2组，用蒸馏水将根部洗净并去胚乳。分别放入2个700ml培养罐中（一个加入完全培养液和蒸馏水，另一个加入缺素培养液和蒸馏水，并离罐顶1cm处），在茎基部用棉花固定。放于阳光充足的地方培养，并每周更换溶液，培养三周。

完全：茎粗，叶绿色、大而厚，无坏死斑点、焦枯，个别叶尖端焦枯是早期有些烧苗。根系发达。 缺N：植株矮小，茎秆柔弱，叶发黄、薄，老叶现象明显（叶中N转移至新叶），叶片分支少，茎秆、叶片出现紫红色（碳水化合物的合成和氨基酸的合成是同步进行的，缺N让碳水化合物过多的积累，生成了花青素）。根系不发达。

缺P：植株矮小，叶暗绿，老叶现象明显，叶片分支少，叶、茎紫红色明显并有些发黑。根系变黄且少。 缺K（调节水势、渗透势，与抗逆性有关酶的激活剂）：茎秆易倒伏，叶片下垂、杯状弯曲，老叶现象明显，叶尖、叶缘出现焦枯。根系不发达。

缺Ca（细胞壁主要成分果胶酸钙的组成元素）：新叶、顶芽钩状坏死，甚至植株死亡。老叶边缘裂、卷皱。根系变黄且少。

缺Mg（合成叶绿素有关，酶的激活剂）：叶片黄化，有锈迹坏死斑点，老叶明显，叶缘紫红色。根系黄且少。

缺Fe（叶绿素构造形成有关，参与电子传递链）：植株生长受抑制，新叶黄色且发白。根系非常不发达。

注意事项：

1. 实验过程中要保护根系，一开始要洗净并去胚乳； 2. 调整水培液PH值，严防试剂污染和混杂； 3. 刚移栽的植株不宜直接放在阳光下； 4. 溶液培养时要用不透明容器； 5. 要经常通气、补水并更换营养液。

思考题：

1.为什么说无土培养是研究矿质营养的重要方法?

用植物必须的矿质元素配成营养液培养植物，可使植物长得与土壤中一样好。用此方法，所用元素的种类和用量可完全认为的加以控制。若要了解某元素缺乏所引起的生理病症，可从营养液中减去该元素。

2.进行溶液培养或砂基培养有时会失败，主要原因何在?

原因有植株根系被破坏、试剂污染、不通气、缺水、营养液没有定期更换。

3.为什么植物缺素病症有的出现在顶端幼嫩枝叶上，有的却出现在下部老叶上，请举例加以说明。

Ca是细胞壁主要成分果胶酸钙的组成元素，且Ca在植株内部可转移，因此，缺Ca植株呈新叶、顶芽钩状坏死。

N则是构成蛋白质、核酸等物质的重要元素，并参与生物体内许多的重要反应，N在植株内可以转移，多从较老部位转移至幼嫩部位，因此，缺N植株呈现老叶先衰。P、Mg也有同样的现象。

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实验四 植物根系活力的测定—TTC法 118

原理：氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生产红色而不溶于水的三苯甲腙（TTF），并在485nm处有最大吸收峰。

生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶实验的H受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC被还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

材料：玉米根系（正常、缺Ca）

操作步骤：把根洗净并吸干水分，取根尖1cm处剪下，分别取0.2g于研钵中+2-3ml乙酸乙酯+少量石英砂研磨，取上清液于试管中，用乙酸乙酯定容10ml、摇匀。如下操作 根鲜重 1mol/l H2SO4 0.4%TTC 保温 1mol/l H2SO4 485nmOD值 0 1 0.456 完全对照 0.2 1 5 完全处理 0.2 5 缺素对照 0.15 1 5 暗处37℃，45min 0 1 0.258 缺素处理 0.15 5 在485nm波长下测OD值。

单位质量鲜根的四氮唑还原强度[ug/(g.h)鲜重]=C/WT； C=OD值/0.952 ； W=0.2；T=0.75h

注意事项：

1. TTC为无色或淡黄色溶液，见光易变性、分解，因此TTC要现配现用； 2. 研磨时要少量多次，直至残渣无色为止； 3. 定容后若溶液浑浊，要重新过滤；

4. 保温要在暗处进行，因为TTC见光易分解； 5. H2SO4的量要准确，确保鲜根被灭活。

思考题：

1. 为什么要测定根系活力？植物的跟与地上部分有何关系？

跟是植物吸收水分、无机盐的部位，也是含有氨基酸、激素供地上部分的部位，根系活力就是脱氢酶的活力，测定根系活力可了解到植株的营养状况。

2. 测根系活力最好选择根系哪个部位？为什么？

最后选择根尖1cm内，因为此处为分生区，是根吸收水和无机盐的部位。以外的部分为成熟区，已失去大部分的能力。

3. 比较缺素与完全根系活力的差异，并解释原因。

缺Ca根系活力明显低于完全培养液培养的植株的根系活力。因为Ca是细胞壁重要组成元素，细胞壁支持和保护细胞，并与细胞生长密切相关，因此缺Ca会使细胞生长受影响甚至死亡，所以缺Ca的根系活力较低。

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