反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用

反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用

林炳生 张太松

510080 广州 中山大学达安基因诊断中心

【摘要】反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值。

【关键词】反向斑点杂交；基因诊断

Reverse dot blot method and its use in gene diagnosis LIN Bingsheng, ZHANG Taisong. Daan Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University,Guangzhou , 510080 China,

【Abstract】 The reverse dot blot(RDB) method, by using biotine labeled primers, amplify the target nucleic acid and hybridize with the probes covalently bound to the nylon membrane. It can identify several kinds of target sequence in a single assay with reliability and specificity. RDB assay was widely applied to the pathogen identification, gene point mutation assay, genetic polymorphism detection, and provides a promising tool for clinical nucleic acid analysis.

【Key words】reverse dot blot(RDB)；gene diagnosis

反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。本文拟对该技术的原理、方法、特点及其应用作简要综述。

1 原理和方法

RDB检测点突变仍遵循等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotide, ASO)法的基本原理[1]，即通过位于寡核苷酸探针中部的等位基因(或序列)特异性碱基与靶序列DNA的碱基配对和严格条件下杂交和洗脱来达到检测基因中少数碱基变化(少至单个碱基)的目的。与传统ASO点杂交不同的是，RDB以膜上固定ASO探针取代了固定靶DNA(基因组DNA或PCR扩增片段)，这就是“反向”的含义（如图1所示）。最初探针固定的方式是先用末端转移酶在合成的ASO探针的3'端加上一段多聚(dT)尾链(一般为400个碱基左右)，这种带尾的ASO点到膜上后再经紫外光照射，其多聚(dT)即可与尼龙膜表面的氨基作用而结合在膜上。1991年Zhang等[2]建立了使ASO与膜共价结合的化学法。此法先用EDC(乙基二甲氨基丙碳二亚胺)对膜进行“活化”处理，继而将5'端带有修饰氨基“臂”的-NH2与膜表面的-COOH相互反应形成共价结合。由于化学法结合效率高(80-90%)，且稳定性好(制备的ASO膜条室温下至少可存放半年)，目前已被普遍采用。

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