热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定(3)

　　2.4  RT?PCR检测
    
　　提取经重组腺病毒感染的Hela细胞总RNA经RT?PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后可明显观察到特异性长为1 486 bp大小的片段，而未感染腺病毒和热应激处理后的Hela细胞此条带相对较弱。见图3。
　　图1  目的基因的RT?PCR扩增及重组质粒pAdTrack?CMV?HSP70的双酶切分析（略） 
    
　　①Marker DL15000;②HSP70 mRNA RT?PCR产物;③pAdTr?ack?CMV?HSP70 PCR 产物s;④pAdTrack?CMV?HSP70/KpnⅠ与EcoRⅤ酶切产物;⑤pAdTrack?CMV?HSP70
　　图2  同源重组质粒的PacⅠ酶切鉴定（略） 
    
　　①Marker DL2000;②Ad?HSP70 PCR产物；③pAdTrack?CMV?HSP70/PacⅠ酶切产物;④Ad?HSP70/PacⅠ酶切产物；⑤Ad?HSP70；⑥Marker DL15000
　　图3  RT?PCR检测Hela细胞中HSP70的表达（略） 
    
　　①Marker DL2000；②vAd?HSP70感染Hela细胞；③未感染腺病毒和热应激处理的Hela细胞；④Hela细胞对照
　　3  讨论
    
　　生物体在受到周围环境刺激或不良因素影响时，会产生一系列为适应环境变化而做出的快速细胞代谢调节。在这期间，细胞内某些正常基因的表达受到抑制，而另外一些特殊的基因则被激活，表现为表达上调，其中热休克蛋白就是这类特殊的基因。迄今为止，已发现30余种热休克蛋白，根据同源性和相对分子质量大小，可将其分为HSP70、HSP90、HSP60、小分子HSP以及泛素等[1]。其中HSP70是热休克蛋白家族中含量最多也是最保守的一类。

　　研究发现，HSP70具有明显增强应激状态下细胞对损害的耐受程度、维持细胞正常功能代谢和提高细胞生存率等作用[2]。DONNELLY等[3]研究结果表明，HSP70在心肌细胞的过量表达是提高心肌对缺血再灌注耐受性的重要途径之一。KINOUCHI等[4]用免疫组化法检测大鼠大脑中动脉阻断后HSP70蛋白的表达，研究结果显示HSP70 蛋白在梗死灶周围神经元，即缺血半影区大量表达。MATSUYAMA等[5]和SAKURAI等[6]将缺血预处理分别用于狗和兔的脊髓缺血性损伤保护作用的实验研究，他们在脊髓缺血前48 h进行缺血预处理，发现脊髓缺血后HSP70的表达增强而且表达时间延长，因而减少随后的脊髓缺血造成的损伤。在这诸多研究中，大多采用热诱导、缺血预处理等方法来诱导内源性HSP70的表达，以证明其保护作用。这种方法简单、直接，但是仍存在一些弊端。因为实验过程中，在对机体给予热刺激或者缺血预处理等的同时，除HSP70基因水平的升高以外，其他基因的表达也会不同程度地受到影响。相对而言，利用分子生物学技术将携带外源性HSP70基因的载体导入特定细胞，使其在细胞内稳定表达，能够更加客观地研究HSP70在应激状态下对靶细胞的保护作用。因此，如何大量获取外源性HSP70基因和选择高效、安全的载体就显得格外重要。
    
　　HSP70普遍存在于所有真核和原核生物体中，但表达量很低。而在机体处于应激状态，包括热应激，化学物质（氧自由基、乙醇等）刺激，缺血低氧，感染以及严重创伤等时表达量明显增加[7～9]。而在这些应激中，热应激是诱导HSP70大量表达的最重要因素。研究报道，虽然肿瘤细胞内HSP70的表达高于正常细胞，但含量仍然较低,将其在热疗等应激条件下处理后HSP70产生明显增多[10]。而对于不同温度诱导引起HSP70表达量的差异，VAN等[11]报道，较激烈的热诱导（43 ℃）作用于肿瘤细胞仅有少量HSP70蛋白表达，而较缓和热诱导（42 ℃），可于诱导后8 h出现且持续高水平表达的HSP70蛋白，激烈的热休克刺激(45 ℃)可导致肿瘤细胞来不及合成HSP70，以致死亡。在本实验中我们从温热休克处理后8 h人宫颈癌细胞系Hela中提取外源性HSP70 mRNA作为模板进行扩增，结果显示扩增后目的基因与理论预计值相符，经测序与GenBank中的序列一致。同时，我们选择了宿主范围广、包装容量大，对人致病性低、滴度高，在增殖和非增殖细胞中均感染和表达基因且与人类基因同源的腺病毒作为载体[12]，并通过AdEasy系统与骨架质粒pAdEasy?1在大肠杆菌内同源重组而获得重组腺病毒载体[13]。

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