自琼脂糖凝胶中回收纯化目的基因，然后与PMD?18T载体在连接酶的作用下进行连接，将连接产物以1×TSS 两步法转化E.coli JM109，涂布于氨卞抗性的LB平板，37 ℃过夜培养。次日挑取平板克隆振荡培养后提取质粒，KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选阳性克隆，产物送上海生工生物技术有限服务公司测序。
1.2.3 穿梭载体pAdTrack?CMV?HSP70的构建 测序确证序列正确无误后，分别用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切目的基因片段和穿梭载体pAdTrack?CMV，并在T4 DNA连接酶作用下以摩尔比1∶3进行连接。将连接产物全部转化已准备好的感受态细菌JM109，取转化菌涂布于含卡那抗性的LB琼脂平板，37 ℃培养14～16 h。然后，从转化菌平板上挑取若干个生长良好的单个菌落接种至5 mL含卡那霉素的LB 培养液中，37 ℃振荡培养16～24 h，取1.5 mL培养液用碱裂解法小量提取质粒。将所提质粒使用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ进行双酶切电泳鉴定，阳性克隆命名为pAdTrack?CMV?HSP70。
1.2.4 重组腺病毒载体Ad?HSP70的构建 将pAdTrack?CMV?HSP70线性化和去磷酸化，随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy?1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。自平板挑取较小克隆转入卡那抗性LB培养液中振荡培养16 h，采用碱裂解法小量提取质粒，进行PacⅠ酶切鉴定，鉴定为阳性者命名为pAd?HSP70。
1.2.5 293细胞包装腺病毒和重组腺病毒滴度测定 QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化Ad?HSP70后,用PacⅠ酶切线性化，脂质体法转染对数生长期的293细胞包装重组腺病毒，同期制备载体对照。用本原正阳公司快速腺病毒感染滴度（TCID50）检测试剂盒测定所获腺病毒滴度，操作按说明书进行，并计算病毒滴度。计算公式：病毒滴度=101+d(s+0.5)×103U/L， d=log10稀释度，s=阳性比率之和。
1.2.6 病毒感染靶细胞后RT?PCR检测目的基因 取100 μL重组腺病毒液感染Hela细胞，3 d后约90%的细胞观察到绿色荧光时收集细胞， TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA，应用RT?PCR检测目的基因mRNA的表达。并取5 μL DNaseⅠ消化处理的RNA直接作为模板进行PCR作为对照，以确定是否有DNA污染。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 HSP70编码基因的PCR扩增及pAdTrack?CMV?HSP70的酶切鉴定
采用RT?PCR自热刺激Hela细胞扩增HSP70编码序列cDNA，可在约1 486 bp处观察到特异性扩增条带，与理论预计值相符且测序后与GenBank报道的HSP70编码序列完全一致。见图1。内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切重组质粒pAdTrack?CMV?HSP70，电泳后可观察到长约9.2 kb的载体片段和长1 486 bp的目的基因片段，表明目的基因片段成功插入表达载体。
2.2 重组腺病毒载体pAd?HSP70的鉴定
重组腺病毒载体pAd?HSP70经限制性内切酶PacⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳可观察到长4.5 kb和30 kb左右的两条带，结果提示穿梭质粒pAdTrack?CMV?HSP70和骨架质粒pAdEasy?1的重组发生在ori与右臂之间。见图2。
2.3 重组腺病毒的包装
质粒pAd?HSP70经PacⅠ酶切线性化后，用脂质体法转染293细胞，转染48 h后在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光，表明质粒转染成功，外源基因开始表达。之后表达绿色荧光蛋白的细胞数目逐渐增多，转染后5 d达高峰，细胞开始变圆、脱落，第7～9天约90%的细胞表达荧光蛋白时收获细胞，反复冻融3次后离心除去细胞碎片，取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒，24 h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多，说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3～4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒，所获病毒命名为vAd?HSP70，经检测病毒滴度为3.2×1012 U/L。
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