用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展

【关键词】  慢病毒载体;基因治疗;人类免疫缺陷病毒Ⅰ型;综述
基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其他难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一愿望的最大障碍。慢病毒(LV)属于逆转录病毒属的一个亚科，其中包括灵长类LV如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV?Ⅰ)、HIV?Ⅱ、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类LV如Visna病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎?脑炎病毒(CAEV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等7个亚属。其中对HIV?Ⅰ的结构及生物学特性研究较多。HIV?Ⅰ具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、感染率高、免疫反应小等优点，弥补了逆转录病毒载体和腺病毒载体等病毒载体的缺陷，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。本文对该类载体的研究进展做一综述。
　　1 LV的基因结构[1～3]
　　人类免疫缺陷病毒直径110～120 nm，呈20面体对称结构，大致呈球形。病毒外膜是磷脂双分子层，来自宿主细胞，膜上有表面蛋白(gp120)与镶嵌蛋白(gp41);gp41是跨膜蛋白，gp120为刺突，并与gp41通过非共价作用结合。包膜内面是由蛋白P17形成的球形基质蛋白(Matrix)，以及衣壳蛋白(p24)形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组和其他来自宿主细胞的成分(如tRNAlys3，作为逆转录的引物)。
　　病毒基因组是两条相同正股RNA链，全长约9 200 bp。两端是长末端重复序列(LTR)，含顺式调控元件,序列为5′U3?R?U5 3′，控制前病毒的表达。现已证明，在LTR有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列至少编码9个蛋白，可分为3类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。结构蛋白由Gag、Pol、Env基因编码。gag基因产生相对分子质量55 000的蛋白P55。P55由病毒编码的一个蛋白切成4个小蛋白：MA(P18基质蛋白)、CA(P24衣壳蛋白)、NC(P7核衣壳蛋白)及P6。Gag?Pol融合蛋白由病毒编码的一个蛋白切为4个小蛋白： RT(P50逆转录酶)、RNase H(P15 RNA H)、IN(P31整合)及Pro(P10蛋白)。Env起先是相对分子质量160 000的蛋白,在感染宿主细胞之后，宿主细胞将gp160切为gp41与gp120。调控蛋白由tat、rev基因编码,Tat和Rev蛋白分别在转录及转录后水平对病毒基因表达进行调节。辅助蛋白由4个辅助基因vpu、vpr、vif、nef编码。MAN、IN和vpr这3种分子元件决定了LV载体能转导非分裂期细胞。这3类蛋白利用细胞核的输入机制，靶向作用于细胞核的前整合复合物(PIC)。细胞核的输入系统包括：胞质蛋白、importin?a、importin?b及核孔蛋白。importin?a含有一个细胞定位序列(NKS)的结合位点，当含有NL的蛋白与importin?a结合发生构象变化，与importin?b相互作用，然后importin?b通过与核孔蛋白结合，靶向作用于核孔复合物[4]。而在实际构建时，vpr可以完全敲除而不影响LV载体感染非分裂期细胞的能力。
　　2 LV载体系统的演进
　　对LV载体进行改造使其具有高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性一直是研究的热点。到目前为止，已有3代LV载体产生。第一代LV载体以来源于人的HIV?Ⅰ研究最为广泛。保留顺式作用元件包括病毒本身的LTR以及病毒的包装信号ψ、Gag基因部分p17区域、Rev反应元件(RRE)。应用限制性内切酶等工具逐渐去除掉野生型LV复制所需要的Gag、Pol、Env基因，部分除掉vpu、vpr、vif、nef致病基因，以保证载体的生物安全性。由于这种载体已经缺少形成完整病毒所需要的蛋白基因，所以它不能依靠自身基因形成完整的病毒颗粒[5]。而后将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中，一个表达Gag和Pol,另一个表达Env,即转移质粒、包膜表达质粒和辅助质粒。转移质粒带一个强启动子，如CMV启动子用来控制除Env以外所有病毒结构基因的表达，它还保留了病毒的LTR区并且被插入了外源基因，在转移质粒上人工插入标记基因(如LacZ、NeuoR、Gpt、Gfp)并可以在标记基因之后外源基因插入之前引入内部核糖体进入位点(IRES)，这样就可以由一个启动子来转录出一个双顺反子mRNA，而由不同的核糖体来分别翻译出两种蛋白。第一代LV载体系统的特点是在构建3种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，尽可能减少3种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留了HIV的辅助基因。第二代LV载体在生物安全性上作了大量的改进，包装结构基因质粒上进一步删去了编码辅蛋白Nef、Vif、Vpr的基因[6]，只保留了gag、pol、tat、rev，生物安全性进一步提高。第三代LV载体的主要特征是构建了自我失活型的质粒(删除了病毒3′端LTR上的U3)。因为在病毒整合宿主基因组后，病毒3′端LTR的U3发生跳跃后能启动病毒基因的转录。而U3是病毒的启动子，当删除病毒3′端LTR的U3后，病毒基因组就不能复制，即使在发生病毒基因与宿主基因重组的情况下，病毒的基因组也不能被复制，因此只能转录整合目的基因，消除了产生活性病毒的可能性[7]。另一种改进是在LV载体包装结构基因质粒上进一步删去了tat基因。总之，第三代LV在不影响感染能力的前提下，其生物安全性大大提高。

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