3 三质粒表达系统
根据以上原理，NALDINI等[8]和KAFRI等[9]构建了三质粒表达系统。三质粒系统是由包装质粒、包膜质粒及转移质粒组成的。其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV?Ⅰ复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白Vpu;包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV?G)等异源性基因代替env基因，HIV?Ⅰ载体的感染谱得以扩大，HIV?Ⅰ载体颗粒获得高度稳定性并可在转移质粒中插入标志基因(绿色荧光蛋白GFP);转移质粒上还可以插入需要转入靶细胞的目的片段。通过三质粒共转染293T细胞,就可以生产复制缺陷的HIV病毒。
4 LV的基因治疗
肿瘤基因治疗是继手术、放疗等传统治疗方法之后出现的一种全新的肿瘤治疗方法。LV载体能够将肿瘤治疗基因安全高效地转移到人体内，使治疗基因长期、稳定、高效的表达。目前在基础和临床方面取得了许多进展。
TRONO [10]认为重组LV载体是目前最适合神经系统退行性疾病基因治疗的载体系统。LV载体安全高效的特点使其在神经系统疾病中的应用越来越广泛[11]。杨宇等[12]采用目前安全性最高的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组LV载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。目前,体内外实验中均未发现LV载体对正常组织细胞有毒副作用,不编码病毒蛋白,在中枢神经系统内不引起免疫反应[13]。马晓生等[14]研究显示，LV载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体，并成功构建含hBMP2基因的LV载体，收集到有活性的能表达目的蛋白的重组LV,为今后用于临床骨缺损基因治疗方面的研究提供了重要的理论依据和材料。作为基因治疗中常用的靶细胞，T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞,在移植物抗宿主病等疾病中起到重要的作用。提高目的基因对T细胞的转导效率对于这类疾病基因治疗具有重要的意义,这是目前研究的重点和难点。李振宇等[15]构建了以HIV?Ⅰ为基础的LV三质粒系统,并以绿色荧光蛋白基因(GFP)作为标志基因,观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。感染小鼠T淋巴细胞48 h后,荧光显微镜下观察到T淋巴细胞内含有绿色荧光,证实GFP基因在其中表达, FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%,较同样条件下逆转录病毒载体感染小鼠T淋巴细胞的效率(23.2±3.5)%[16]为高(P<0.01)。林健等[17]成功利用LV介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV?TK)基因转导大鼠胶质瘤细胞，为后续的脑胶质瘤基因治疗提供了可靠基础。
造血干细胞是一种具有自我更新能力和多分化潜能的细胞，被认为是基因治疗中最有发展前景的靶细胞。MAY等[18]证实LV载体能够将目的基因转移到靶细胞中，并能在其中长期表达。
5 存在问题及展望
尽管HIV?Ⅰ载体研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒滴度还不够高，难以达到体内应用的需要;其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像目前常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想[19,20]。研究报道，Vpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂[21]，也是建立包装细胞的主要障碍之一。如果去除包装质粒中的vpr基因而不影响载体的转导能力，则可以建立稳定的包装细胞。 LV载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，其技术操作简便，能高效地将目的基因以单拷贝的形式插入宿主染色体中，基因表达效率高，对宿主细胞功能系统有良好的适应性。相信该载体会对医学的发展产生重要的意义。
【参考文献】
[1]IKUTA K, KAMEOKA M, LUFTIG R B. AIDS pathogenesis: the role of accessory gene mutations, leading to formation of long?lived persistently infected cells and/or apoptosis?inducing HIV?Ⅰ particles[J]. Virus Res, 1997,52:145?156.
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