实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选
——培养基配制及样品采集
一、实验目的
学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理
自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三 实验材料
1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、记号笔等。
2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样：
用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
（注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。
从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，
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且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。） 2．筛选培养基配制：
筛选培养基配方（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂粉15，pH 7.5。每500ml三角瓶装200ml培养基，121℃灭菌20min，备用。 3．无菌水制备
250ml三角瓶，加入50 ml蒸馏水，玻璃珠8颗，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。
试管10支，装9ml/支蒸馏水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。
培养皿包封，灭菌后备用。
1ml吸管若干，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。 涂布棒包扎后灭菌，备用。 五、思考题
1．你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？
实验十一、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选
——样品处理及初筛
一、实验目的
学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法进行芽孢菌初筛的技术。 二、实验原理
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行
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分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
枯草芽孢杆菌在自然界中分布很广，在很多的环境中经常能够找到。由于其体内能够产生芽孢，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热的微生物杀死得以富集。 三、实验材料
1. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。 2. 试剂：芽孢染色液。
3. 其他器具：超净工作台、显微镜、培养皿、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接种环、酒精灯等。 四、操作步骤 1．样品稀释：
称取土样10g，加入到备好的玻璃珠和无菌水（90ml）的三角瓶内，振摇5 min。按微生物稀释法操作，稀释到稀释到10－3～10－5稀释度。 2．加热处理：
取最后三支土样稀释液，置于100℃水浴中3～5分钟后，灭活营养细胞，保留芽孢。
3．涂布平板和培养：
培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取0.1ml涂布平板，30℃倒置培养24h以上。 4．形态观察
进行单染色或者芽孢染色方法，观察你分理出的细菌的芽孢产生情况。 五、思考题
1．你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？
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