用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱(4)

以直接作为FISH的模板DNA分子,用于构建DNA分子图谱。这样将会大大简化图谱构建的过程和加快图谱构建的速度。

在DNA纤维上进行FISH在人和动物上发展四年之后,这一技术也被我们成功地引入植物(Fransz等,1996)。由于植物细胞具有与动物细胞明显的不同特点,如果用单细胞作为制备DNA纤维的材料,植物细胞的细胞壁将会是一个很大的障碍,为了克服这个困难,我们首先从叶片中提出游离的细胞核,片上,通过lysisbuffer的处理,能够得到直线的、平行的DNA纤维。

核糖体(ribosomal)DNA的组织结构,能够直接排列和定位1kb左右,检测信号的灵敏度低于700bp,所得到的DNA纤维的分子结构都十分类似,DNA)都在3.0～3.5kb/μm之间(Wiegant等,1992;Houseal等,1994;;1995;Fransz等,1996)。这一数值已十分接近Watson和Crick建立的

94kb/μm,这说明所得到的DNA纤维很可能已是分离出的没有蛋白质复合的DNA综上所述,由于所使用的靶DNA切片的染色体或DNA分子结构的不同,FISH技术所能达到的分辨率水平有很大的差别。以番茄染色体为例,粗线期染色体的浓缩度比中期染色体要低大约10-15倍,而DNA纤维比中期染色体低900倍左右。这里我们对各种FISH技术的特点,包括分辨率水平、可检测DNA序列的范围、以及优点和缺点进行了总结和比较(见表1)。

高分辨率的DNA荧光原位杂交技术能够快速准确地得到探针序列之间的顺序、方向和真实的物理距离。在具体应用这一技术时,根据不同染色体和DNA纤维的结构特征,选择适当的靶DNA载体是很重要的。根据我们的研究结果认为,如果从性细胞中制备粗线期染色体在技术上可行的话,在这种染色体切片上进行FISH,可以直接准确地找出与目的基因相关的DNA探针克隆在染色体特定区域内的定位,确定相距100kb以上的DNA序列之间的顺序和相互位置关系。一旦目的基因的范围被缩小到100kb以後,可以直接在DNA纤维上进行FISH,快速准确地构建出这一区域的DNA物理图谱。把在粗线期染色体和DNA纤维上的FISH技术与现有的分子生物学技术相结合,将有效地加速大范围DNA物理图谱的构建,以及分离和克隆目的基因的进程。

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