用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱(3)

3在间期细胞核上的荧光原位杂交

在制备染色体切片时,很容易得到大量的间期细胞核。这些细胞核没有典型的染色体结构,但其染色质在这一时期却比分裂时期的染色体浓缩程度低很多,荧光原位杂交的分辨率也会比染色体高很多。Lawrence等(1988)首先观察到两个DNA。Trask等用50kb到1Mb范围里的DNA探针序列的间期细胞核荧光原位杂交分析表明DNA分子的直线距离有很强的相关性(Trask等,1989),两个相距50kb。用三色间期细胞核荧光原位杂交技术,Trask等()。但DNA2Mb之后相应减弱,这可能与间期细胞核中染DNA结构已比染色体上的浓缩度降低了许多,但它仍保持着细胞中原有的空间结构。FISH的分辨率水平只能达到50kb左右。

4在游离染色质上的荧光原位杂交

要突破FISH分辨率的限制,须考虑人为地改变染色质的原有空间结构。Heng等(1992)首先提出,用碱性溶胞剂(alkalinelysisbuffer)对处于G1和G2期之间的间期细胞核进行处理,释放出游离的染色质丝(freechro2matin),这种染色质丝已经失去了原有的细胞空间结构,其DNA的浓缩度更进一步降低。在对350kb范围里的5个cosmid克隆进行FISH定位之后,两个相距21kb的克隆能够在游离染色质上完全被分开,杂交信号之间的距离与DNA的实际距离之间存在良好的线性关系。根据实验统计,每微米游离染色质丝大约相当于80kb的DNA分子长度。其FISH分辨率的水平能接近10kb,可用于分析1Mb范围内DNA序列的位置关系。

5在DNA纤维上的荧光原位杂交

游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构,但它仍是DNA和蛋白质的复合大分子,其染色质的基本结构核小体和组蛋白并没有遭到破坏。在Heng等人(1992)的思路的基础上,Wiegant等(1992)、Parra和Windle(1993)进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理,让DNA分子完全从蛋白质中分离出来,制备出DNA纤维(extendedDNAfibre)。Wiegant等用一种含高浓度盐和一定量的变性剂(detergent)的碱性缓冲液对间期细胞核进行处理后,得到一种被称为Halo的DNA纤维结构围绕在细胞核周围。这是一些环状DNA分子片段,通常有400-500kb长,可以用来作为高分辨率的FISH的靶DNA。Florijn等(1995)用这种Halo切片对400kb范围内的cosmidcontig进行FISH图谱定位之后,发现其分辨率水平能达到低于1kb。Parra和Windle使用的技术略有不同,他们将游离的单细胞培养液涂在载玻片上,然后用一种含有SDS和EDTA的lysisbuffer溶解细胞5分钟,再将载玻片倾斜至

45度角,随着缓冲液的向下流动,直线的DNA纤维分子便从细胞中拉出。在这种DNA纤维上进行多色FISH,能够直接观察到3-5kb的质粒DNA(plasmid)探针在DNA分子上的直线排列。这时观察到的荧光杂交信号已不再是单个的点,而是由许多点组成的线。探针分子的长度能够通过对荧光信号长度的测量来推算。并且不同DNA序列之间的重叠(overlap)和间隔(gap)都能直接在显微镜下看到。在1Mb的DNA范围里,FISH定位的分辨率能够到达1～2kb,与常规分子生物学的限制性内切酶图谱法(restrictionmapping)差不多。但它具有更快速、更直接、更简便的优点。

进一步,Heiskanen等用脉冲电泳(PFGE)分离大分子DNA,再从含有大分子DNA的葡聚糖胶块(agaroseblocks)中提出DNA分子,直接在载玻片上制备DNA纤维。这种DNA纤维分子同样适用于FISH。它暗示从脉冲电泳中分离的50kb到2Mb的DNA大分子,如人造酵母染色体(yeastartificialchromosomes,缩写为YAC)DNA可

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