线虫的EMS诱变和突变体筛选2015 - 图文(2)

（12）当菌长满培养皿的时候，若不立即接种，可以在4℃倒置放置一段时间，但不要放置时间过长，原因如下：①菌的寿命也有限，时间越长，菌的活性越低；②菌的尸体会影响对线虫的观察。

（13）Op50所生长的NGM固体培养基是没有加氨苄的，操作不当容易长菌。长菌的板容易使线虫诱变，所以在超净台上操作的时候一定要注意不要污染。 （14）在找突变体之前可以先观察突变体线虫的样板，对照着样板的突变体找诱变的突变体，找到突变体之后再将其与野生型突变体对比，以确认找到的突变体是否典型。

（15）找突变体的时候在解剖镜下找，这样好挑线虫，挑线虫的时候要用灼烧过又冷却至室温的的pick挑，以免污染培养基。观察突变体线虫的时候在显微镜下观察。 （16）刚从培养箱或冰箱里拿出来的培养基上可能有少许水，可先将其在桌面上倒置一会儿再使水流到培养皿皿盖，然后再用火烤烤皿盖将水烤干，倘若培养皿上水汽太多，刚刚接入的线虫会成游泳状运动，让人误以为是突变体。

（17）整个实验过程中要估计好线虫生长时间，在20℃，线虫的生长周期大约是4天，如果没有及时挑突变体，可以根据线虫的生长周期推断挑的突变体是F1代突变体还是F2代突变体等，不过这种方法也不能保证诱变的培养基中的突变体是第几代，因为基因突变也可以是自发产生的。因此，培养基一定要事先配好，不要误了挑选突变体的时间，这样才能一步步地筛选能够稳定遗传的突变体。 （18）挑完突变体一定要找同时期的野生型线虫在同一显微镜下作对比，这样可以确保找到的突变体是否真的与野生型不同，在进行对比的时候不要反复地调节细准焦螺旋，因为在调节细准焦螺旋的时候会产生视觉误差，就算是同一只线虫在转换细准焦螺旋观察的时候也会觉得粗细有所变化。

（19）在观察运动障碍的突变体时，只有细心观察才能找到运动障碍的突变体，我们找到的只能向左转弯的运动障碍突变体就需要长时间的观察才能找到，它的头部总是在摇摆，当感觉要向右运动时就突然停止运动，而是向后退，但是大多数情况，这种线虫会向左运动。 （20）长菌的培养皿容易诱变出气泡的突变体，由于这种形状是环境诱导的，很可能是不可遗传的突变，因此，长泡线虫的后代几乎观察不到身体上有小泡的线虫。

（21）本实验的连续性强、时间跨度大，因此要注意每步实验操作，避免出现错误（如没有无菌操作、没有及时挑取突变体等），否则就会对实验结果产生影响。

（22）长菌的培养基并不影响线虫生长，只是影响线虫观察影响，尽管少数时候会诱导长泡型的突变体产生，但是千万不能因此去用pick挑走菌落，这样不但会使培养基里长出更多因挑菌而产生的分散的菌落，还极有可能将隐藏在菌里面的线虫突变体或卵挑走。我们实验最后突变体的培养皿中只能观察到很少的突变体可能就是这种挑菌行为造成的。

（23）当转移突变体的时候不慎混入非突变体的线虫，要尽量用pick挑走，否则突变体的后代会混入大量野生型线虫，不利于观察突变体后代。

（23）此次挑选突变体的过程繁琐，可以做如下改进：①在用EMS诱变4~5个小时之后转移线虫至NGM培养基的时候可以每个培养皿放10只虫子，转3~4个皿，转入过多的虫子对后代突变体观察造成障碍②当差不多每个NGM培养基里的亲代线虫产出100个卵的时候，用M9洗走培养皿中的线虫，因为诱变的线虫的最先排出的卵是最容易产生突变体的，这样使后面的筛选工作变得省时省力。③3天之后培养中就长成了F1代成体线虫可供观察，再过20小时，（20℃时，线虫在由卵长到可以排卵的成体线虫需要65个小时，96个小时即达到排卵最大值）便可用M9洗走培养皿中的F1代线虫，等F2代线虫长到特定时期观察突变体。这种方法获得的2代线虫突变体概率多至25%，突变率大大提高。④3天之后便可挑选F2代线虫突变体，将每中突变体挑选一只放到新的NGM培养基中，观察F2代线虫突变体产生的F3代是否也为突变体，如果还是突变体表形，则证明我们获得了能够稳定遗传的突变体，

如果F3代不为突变体表形，那么，就说明我们选取的F2代线虫突变体是不可以稳定遗传的突变体。对于稳定遗传的突变体可至于-80℃长期保存。

参考文献

［1］ THE ART AND DESIGN OFGENETIC SCREENS:CAENORHABDITIS ELEGANS. Erik M. Jorgensen* and Susan

E.Mango

［2］ 张文霞，戴灼华.遗传学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2007.

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