线虫的EMS诱变和突变体筛选2015 - 图文

线虫的EMS诱变和突变体筛选

摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。 关键词：秀丽隐杆线虫同步化 EMS诱变无菌操作技术突变体

1.引言

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存

线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对 RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。

基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。

目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症 (Alzheimer’s, AD)，多囊肾病 (polycystic kidney disease)，Duchenne 肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。

甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，

最终获得能够稳定遗传的突变体。

2.材料和方法

2.1 材料、试剂和器材

实验材料：N2型秀丽隐杆线虫。

实验试剂：NGM（Nematode Growth Media）固体培养基、LB液体培养基、M9线虫生理溶液。

实验器材：培养皿、报纸、锥形瓶（500ml、300ml、100ml）、15ml离心管、蓝枪尖、黄枪尖、Ep管、5ml的塑料试管、高压蒸汽灭菌锅、离心机、酒精灯、移液枪（1000ml、200ml）。 2.2 方法

2.2.1仪器的洗涤、包装与灭菌，相关溶液的配制。 （1）仪器的洗涤与包装

①用自来水洗涤55mm培养皿（我们组一次性洗12个培养皿），晾干后用报纸包装好，以待灭菌。

②洗涤500ml锥形瓶，300ml锥形瓶，100ml锥形瓶，15ml离心管若干，锥形瓶装入液体后，用锡纸封口，15ml离心管用报纸包好，以待灭菌。

③将蓝枪尖和黄枪尖塞入枪尖盒，用报纸包装好以待灭菌。

④将Ep管和5ml的塑料试管管放入玻璃瓶中，用报纸封口，以待灭菌。 （2）相关溶液的配制

①NGM（Nematode Growth Media）固体培养基的配置 按表1配置NGM固体培养基

表1NGM固体培养基的配方

NGM固体培养基 NaCl agar typtone dH2O 150ml 0.45g 2.6g 0.375g 146ml 400ml 1.2g 6.8g 1.000g 390ml 120℃灭菌15分钟，然后在无菌的条件下加入下列灭菌的溶液 CaCl2(1M) 0.15ml 0.40ml MgSO4(1M) 磷酸缓冲液(1M)Ph6 胆固醇（1.5g/ml） ②LB液体培养基的配置

按表2配置LB液体培养基

表2LB液体培养基的配方

0.15ml 3.75ml 0.15ml 0.40ml 10ml 0.40ml LB液体培养基 typtone yeast NaCl dH2O 120℃灭菌15分钟 ③M9线虫生理溶液的配置 按表3配M9线虫生理溶液

200ml 2g 1g 1g 200ml 表3 M9线虫生理溶液的配方

M9线虫生理溶液 KH2PO4 Na2HPO4, NaCl dH2O 120℃灭菌15分钟 MgSO4(1M) 500ml 1.5g 3g 2.5g 500ml 0.5ml (3)仪器与溶液的灭菌 ①打开高压蒸汽灭菌锅，设置灭菌温度120℃和灭菌时间10分钟，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀，高压锅继续升温，自动灭菌。

②在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。 2.2.2倾倒NGM平板，摇菌与铺板

（1）倾倒NGM平板

①紫外灭菌无菌操作台5分钟。

②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。

③待固体培养基冷却至60℃，在酒精灯附近逐一倾倒平板，保证每个平板有NGM固体培养基约10ml。

④在培养皿皿盖上做好标记（包括组名，日期），待NGM固体培养基冷却后，如果不用菌液铺板，就用封口膜封口后倒置于4℃冰箱保存，如果菌液已经活化，则可直接铺板。 （2）菌种的活化与铺板

①紫外灭菌无菌操作台5分钟。

②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。

③取出两管高压后的15ml离心管，用移液枪吸取液体配养基3ml,加入原始的OP50菌液300μl，过夜摇菌。

④取200~300μl活化的菌液均匀地铺在NGM固体培养基里，用手摇动晃匀菌液，封口膜封口后，平置于操作台上待菌液被吸收。

⑤等菌液被NGM固体培养基吸收后（一般20分钟），在37℃培养箱倒置培养，等细菌长出薄薄的一层（一般12-24hr）即可接线虫或倒置放在4℃冰箱保存。

⑥摇菌剩余的菌种可以与甘油1比1混合，颠倒摇匀，至于-20℃保存。 2.2.3.怀卵成虫的同步化

（1）选择一个含有大量怀卵成虫的培养皿，用3mlM9洗下，放入5ml的塑料试管，加入0.8ml20%次氯酸钠，0.4ml0.5M的NaOH（事先配置次氯酸钠和NaOH各1ml）。10min后，虫体破裂，溶液变澄清。

（2）3000转离心1min，弃上清。

（3）4mlM9，混匀，3000rpm，离心1min，弃上清。 （4）重复步骤（3）2~3次以去除残留的裂解液。 （5）加入0.2ml M9，混匀。

（6）将液体接种于NGM上，20℃培养，约56hr达到L4或20℃培养24hr,转至25℃培养大约21-22hr达到L4。

2.2.4.EMS诱变和突变体筛选

（1）无菌条件下，将培养皿中处于L4早期的雌雄同体线虫用5ml M9悬浮，用移液器转移至无菌离心管中。

（2）1000rpm离心30s，去除上清，加入2mL M9。

（3）另取一只离心管，加入M9 2ml以及20μl EMS，拧紧盖子，振荡混匀。 （4）2mL 含线虫M9倒入2mL 含EMS M9 中，混匀，用封口膜密封。 （5）室温放置4~5 h，混匀30min。

（6）1000rpm离心30s，去除上清，加入3-4mL M9清洗。 （7）重复（6）3~4次。 （8）自然沉淀，去上清，留下1mL 连同虫子转入NGM板上,每一个NGM板上加200ul，20℃培养2天后至产卵，移去成虫；

（9）继续20℃培养若干天后连续观察，筛选能够稳定遗传的突变体及突变体的子代。

3.结果

在4×（或10×）显微镜下观察到的线虫突变体和对照组如图所示。 3.1运动轨迹变化突变体

12

31

图一 运动轨迹变化突变体的筛

41

选

51

图一所示的是运动轨迹变化的突变体。图1是野生型线虫的运动轨迹，设为对照组，图2至图5是突变后线虫的运动轨迹，设为实验组。图2的运动轨迹较野生型相比更为平缓，图3的运动轨迹较野生型相比更为陡峭，而图4突变体的运动轨迹呈麻花状，图5突变体的运动轨迹极不规则并且十分纠结。这些都是可能是线虫的突变体，但我们发现运动轨迹奇怪的突变体的子代轨迹又往往正常化了，我们做了如下推测：①运动轨迹的突变体是不可遗传的，表现为运动轨迹突变体可能是由环境决定的，或者是线虫发生体细胞突变引起的；②运动轨迹的突变体发生的突变可能是隐形突变，因此在后代所占比例太少，而且运动轨迹在虫子太多的时候又难以观察，所以难以获得稳定的运动轨迹奇怪的稳定遗传的突变体；③运动轨迹奇怪的线虫本身并没有发生突变，可能是由于自身兴奋而产生了奇怪的运动轨迹。

3.2形态特征变化突变体

4 1 5 2 3 6

图二形态特征变化突变体的筛选

图二是形态特征变化的突变体。图1是野生型成体期线虫的形态特征，设为对照组，图2至图6是突变后线虫的形态特征，设为实验组。图2是严重卷曲，极少移动的成体期线虫突变体，图3是背部长小泡的成体期

线虫突变体，图4是身体细虫突变体，图5是短粗的成能向左转弯的成体期运动障突变体中，身体细长，并且弯的运动障碍突变体是可遗突变体的后代都是野生型形体。

长，并且头尾很尖的L4期线体期线虫突变体，图6是只碍突变体。其中，在这几种头尾很尖的突变体和向左转传的显性突变体，其他几种态的线虫，不是稳定的突变

4.讨论

（1）使用高压蒸汽灭菌锅时，一开始当压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后（也可以在5分钟之后），再关闭放气阀，以完全排除锅内空气，使灭菌才能彻底。 （2）灭菌完后，如果时间紧急，可在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。

（3）所配置的液体培养基高压后要分装在几个小量程的锥形瓶中，这样如果操作过程中液体培养基被污染，可防止配置的液体培养基全被污染。

（4）摇菌的时候一种菌摇两管，这样可以保证如果一管菌的菌种引入了杂菌，另一管菌液如果没被污染就还能用。

（5）无菌操作台在使用前应该先紫外灭菌5分钟，操作之前双手也应该用酒精消毒，以防止操作过程中造成实验污染。

（6）细菌要倒置培养，防止水蒸气滴到固体培养基上，影响微生物的生长、线虫的运动和杂菌污染。 （7）在用菌液铺板时，如果培养的是野生型线虫，为了让线虫均匀地在培养基上大量生长，需要均匀地铺板，如果是观察诱变体，则将菌液集中滴在中间，使线虫集中生长，利于观察突变体。

（8）在做同步化的时候，一定要观察到培养皿上有大量化卵成虫再做同步化，不然得到的同步化的虫子会特别少。

（9）如果同步化得到的虫子很少，有两种方法补救：①找一个含有大量化卵成虫的皿再做同步化；②在野生型线虫培养基上选取一块线虫生长时期相同的区域，挖下来，接到新的培养基上，多挖几块继续培养，这样数小时后得到的虫子基本还应该是同一时期的。 在做同步化的时候可以多同步化几个板，这样如果一个板同步化失败了，还会有一个板可以补救。

（10）诱变过程中一定要将EMS洗干净，否则诱变时间太长，线虫会死掉。

（11）一定要让菌在37℃培养箱里铺满再接线虫(一般6~16个小时)，否则容易在挑突变体的过程中造成杂菌污染，如果op50在培养基上长满了，就会形成优势菌种，这样就很难造成杂菌污染。

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