医学遗传学实验指导

人类基因组DNA的提取

实验目的

1．了解DNA提取的原理；

2．学会实验室常用的提取DNA的方法。 实验原理

从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行分子遗传学各项研究的先决条件。制备高质量DNA的原则是：尽可能保持DNA分子的完整；将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。哺乳动物DNA的提取通常是在有EDTA-Na2及SDS一类的去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚、氯仿抽提实现的。在Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）作用下，DNA被释放到上清液中，经过氯仿去蛋白、去酚（因为可有10%的酚溶于水）作用后，乙醇可使DNA分子聚合形成白色或无色絮状沉淀，从而获得粗提DNA。用这一方法获得的基因组DNA大小约有100～150 kb，适用于Southern分析、用λ噬菌体构建基因组DNA文库和PCR反应等。

试剂与材料

枸橼酸钠溶液（ACD）、生理盐水、细胞裂解液、蛋白酶K（10 mg/ml）、10% SDS，STE缓冲液（pH 8.0）、Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）、氯仿（CHCl3）、乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液（pH 7.5）。

实验步骤

一、外周静脉血DNA的提取

1．采集外周静脉血3～4 ml于7 ml管内，加0.5 ml ACD抗凝。 2．加等体积生理盐水，轻轻振荡混匀；1 500 g离心20 min。

3．弃上清液；每管加5 ml细胞裂解液，轻轻上下振荡至透明；1 500 g离心20 min。

4．弃上清液；每管加入STE（pH 8.0）2 ml，蛋白酶K（10 mg/ml）20 ml，10% SDS 200 ml，置37℃恒温水浴箱内，消化过夜。

5．加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀；5 000 g离心20 min。 6．吸取上清液，重新抽提1～2次。

7．加等体积CHCl3抽提2次。

8．吸取上清液至一小锥形瓶中，加入3 mol/L乙酸钠至终浓度为0.3 mol/L。 9．加入2.5倍体积的无水乙醇，可见有白色絮状沉淀物，即为所提取的DNA。轻轻旋转锥形瓶，慢慢将DNA聚到一起。

10．吸出DNA沉淀，放入加有1 ml 75%乙醇的Eppendorf管内；12 000 g离心10 min。

11．弃上清液，室温干燥。

12．加适量（200～500 ml）TE缓冲液，置4℃保存，约2～4天DNA才能完全溶解。

13、用DNA/RNA Calcultor检测DNA的含量和纯度。 二、绒毛细胞DNA的提取

1．绒毛滋养层细胞及羊水细胞的获得：将绒毛细胞放入Hank’s液中，立即在显微镜下分离绒毛枝状物，用生理盐水洗去血污，然后冻存于液氮中或立即提取DNA。

2．绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆，加STE至500 ml，加SDS至终浓度为0.5%，加蛋白酶K至100 mg/ml。37℃水浴过夜，期间振荡2～3次。 3．加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀，8 000 g离心10 min。 4．吸取上清液，加等体积CHCl3，轻轻振荡混匀，5 000 g离心20 min。 5．重复步骤4一次。

6．以下步骤同“外周静脉血DNA的提取”。 三、羊水细胞DNA的提取

1．取羊水20 ml，于4℃、3 000 g离心15～20 min，除去上清液，用生理盐水洗涤沉淀的羊水细胞2～3次，冻存于液氮中或立即提取DNA。

2．绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆；向羊水细胞中加STE至500 ml，加SDS至终浓度为0.5%，加蛋白酶K至100 mg/ml。37℃水浴过夜，期间振荡2～3次。

3．加等体积Tris-HCl饱和酚，轻轻振荡混匀，8 000 g离心10 min。 4．吸取上清液，加等体积CHCl3，轻轻振荡混匀，5 000 g离心20 min。 5．重复步骤4一次。

6．以下步骤同“外周静脉血DNA的提取”。

应用

遗传病的诊断、遗传病的家系系谱分析、人类基因组资源的保存、以及一些具体研究领域的前期工作。

注意事项

1．外周静脉血一般用医用ACD抗凝，也可用EDTA抗凝。因肝素能抑制限制性内切酶活性，故一般不采用肝素抗凝。

2．因Tris-HCl饱和酚（pH 8.0）、氯仿（CHCl3）有较强的毒性作用，在操作过程中应注意防护，防止液体溅到皮肤上，有条件的可以戴乳胶手套以及口罩，保持良好通风。

3．在酚以及氯仿的混合过程中，注意轻轻混匀，切忌剧烈震荡，防止DNA因机械剪切而发生断裂。

4．无水乙醇沉淀DNA的过程中，注意使用室温的无水乙醇，不需要预冷，否则RNA容易析出。

5．不要使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解。可以将其置于摇床平台上慢慢摇动至DNA完全溶解。

DNA的琼脂糖凝胶电泳

实验目的

1．了解琼脂糖凝胶电泳检测DNA的一般原理； 2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测技术。 实验原理

DNA分子携带负电荷，在一定电解质缓冲液存在的条件下，它可以以不同孔径琼脂糖为支持物由电源负极向正极移动。琼脂糖电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常规方法。琼脂糖凝胶可以灌制成各种形状、大小和孔隙度。参数的选择主要取决于所分离片段的大小。

琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200 bp至近50 kb的DNA。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。少至1～10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。

试剂与材料

1．琼脂糖、5×TBE或TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙锭（储存液10 mg/ml）。

2．稳压电泳仪、水平凝胶电泳槽、紫外线检测摄像装置。

实验步骤

1．根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入一定体积的0.5×TBE或1×TBE或其它电泳缓冲液，如TAE。 2．加热溶解琼脂糖。

3．溶液冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5 mg/ml。 4．把制胶模具摆放好，插上梳子。

5．将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度一般约为0.5 cm。

6．室温下放置30～45 min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子，将凝胶放置于电泳槽中。加样孔位置在负极。

7．加入电泳缓冲液（与琼脂糖凝胶的离子强度一致）至电泳槽中，让液面高于胶面1 mm。

8．在DNA样品中加入1/6的上样缓冲液，混匀后，用移液器将DNA样品加入样品孔中。同时将DNA Marker准加在两侧的空样品孔中。

9．接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑色。切记DNA向正极泳动。采用1～5 V/cm的电压降（长度以两个电极之间的距离计算）。 10．根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳，切断电源后，再取出凝胶。直接于紫外灯下观察结果。

结果判断

根据所检测的DNA样品，对比DNA分子量标准在紫外灯下观察凝胶中的条带，是否为自己所需的阳性结果，或是阴性结果，并拍照保留。

应用

对基因组DNA、PCR产物、质粒DNA等DNA片段进行检测，估计样品的有无、质量及浓度等。根据不同需要，可以对一些样品进行回收与纯化。

注意事项

1．电泳前要注意凝胶的位置是否摆放正确；接通电源后，应该观察正、负极铂金丝是否有气泡出现，以便确认是否电泳槽已经接通电源。

2．溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性，使用含有该染料的溶液时必须戴手套。

3．紫外线对人眼和皮肤有一定的损害，观察结果时注意佩戴防护面罩等进行防护。

聚合酶链式反应（PCR）

实验目的

1．了解PCR技术的原理； 2．掌握PCR技术的程序和步骤。 实验原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在体外模拟DNA的复制过程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发聚合反应，短时间内可将要研究的目的DNA扩增数百万倍。

PCR技术操作简单，灵敏度高，对模板DNA的质量和数量要求较低，常规方法提取的DNA和RNA都能满足PCR扩增需要，可在普通实验室完成，结果较为可靠。

试剂与材料

1．样本DNA、上下游PCR引物、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/ml）。 2．微量加样器、PCR自动热循环仪。

实验步骤

一、样品的收集及处理

用于PCR反应的样品可以是已提取的各种来源的DNA分子，也可以选取经处理后的全血、羊水、绒毛。 全血：

1．取全血200 ml用EDTA抗凝。 2．5 000 g离心10 min。

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