大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究(2)

　　2.4  药物抗RSV活性机理的实验

　　
2.4.1  药物对RSV生物合成的抑制作用实验于已长成单层的Hep-2细胞40孔板上，每孔接种100 μl的100TCID50的RSV病毒液，于33℃吸附90 min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在大青叶无毒浓度范围内，加入2，4，8，16，32，64，128 μg/ml的不同浓度的含药维持液每孔0.2 ml，每日观察CPE,隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照CPE为 “+++～++++”（CPE记录方法为：“-”为无CPE;“+”为25%细胞出现CPE;“++”为50%细胞出现CPE；“+++”为75%细胞出现CPE;“++++”为100%细胞出现CPE）时弃培养液上清，用MTT法检测病毒抑制率,并根据如下公式计算药物对RSV的病毒抑制率［2］。
    病毒抑制率（%）=药物处理组OD570-病毒对照组OD570细胞对照组OD570-病毒对照组OD570×100%

　　2.4.2  药物直接灭活病毒实验将50 μl的100 TCID50/ml滴度的RSV和150 μl不同浓度的药物作用4 h，反应体系为0.2 ml。含并保证药物的终浓度与药效学实验相同。然后将混合液接种于单层Hep-2细胞中,孵育1.5 h后，换用2%MEM培养液维持细胞生长，37℃，5%CO2培养,逐日观察CPE。

　　2.4.3  药物抗病毒吸附实验分别将不同浓度的药物加到Hep-2单层细胞孔中, 37℃吸附90 min,弃上清,再加 100 TCID50/ml滴度的RSV 100 μl/孔, 37℃吸附90 min后,弃上清,加细胞维持液,37℃，5%CO2培养,逐日观察CPE。

　　3  结果

　　3.1  病毒滴度按Reed-Muench法计算病毒的TCID50为10-4，即接种滴度为10-4的病毒每孔0.1 ml，可使50%细胞发生明显病变。实验用病毒浓度为100 TCID50。

　　3.2  药物对细胞的毒性将大青叶单体1，2，3，4#和病毒唑及抗病毒口服液的不同浓度对细胞的毒性。结果见表1。表1  大青叶单体1，2，3，4#对Hep-2细胞的毒性作用（略）
　　
　　通过光镜观察,大青叶单体1#，2#，3#，4#对Hep-2细胞毒性作用表现为：细胞粘连，变圆，壁厚，破碎，脱落，胞浆内颗粒增加，折光性增强。并且吸光值明显下降，吸光度OD值在0.10以下。从表1可知，大青叶单体1#，2#，3#，4#与病毒唑和抗病毒口服液的TC50>200 g/ml,说明其安全系数大。药物在160 g/ml范围内约有半数或以上的细胞存活，从而确该药物浓度为对Hep-2细胞敏感病毒的抗病毒实验的最高允许浓度；但细胞经较高浓度的药物作用后，药物毒性增强，死亡细胞数增加，细胞存活率降低（如图1所示）。经直线回归分析，药物浓度与细胞存活率之间存在直线关系，P<0.01。其直线方程和相关系数分别为：Y1# = 59.006－0.042X，r1# = －0.815；Y2# = 63.976－0.045X，r2# = －0.827；Y3#= 64.466－0.045X，r3#= －0.835；Y4# =69.451－0.045X，r4#  = －0.849。4者相比较，1#单体的毒性最大，经t检验，P<0.01；2#单体与3#单体对细胞的毒性作用相同，经t检验，P>0.05；4#单体毒性最小，经t检验，P<0.01。但将4种单体的TC50与阳性药物病毒唑及抗病毒口服液相比，经t检验，P<0.01,有显著性差异，说明大青叶单体的毒性更大。

　　3.3  药物抗病毒生物合成的作用RSV对Hep-2细胞CPE表现为细胞肿胀、变圆，壁厚，折光性减弱，多个细胞融合形成大泡，有合胞体形成48～72 h后，用MTT法按公式计算大青叶单体1#，2#，3#，4#对RSV的抑制率，并根据治疗指数TI= TC50/IC50，计算各种药物的治疗指数。结果见表2。表2  中药大青叶单体1，2，3，4#的抗RSV细胞内生物合成作用（略）
　
　　由表2可知随药物浓度增加，其抗病毒活性增强，病毒抑制率升高（见图2）。经直线回归分析，药物浓度与病毒抑制率间有直线关系，P<0.01。其直线方程和相关系数分别为：Y1#=31.044+0.530X，r1#=0.898；Y2#=34.135+0.538X，r2#=0.806；Y3#=29.490+0.572X，r3#=0.904；Y4#=33.495+0.506X，r4#=0.923。药物浓度在在128 g/ml以上时，对RSV细胞病变抑制程度可达90%左右。4种单体的IC50和TI相比较，4#单体的IC50值略小，TI值略大于其他3号单体。但通过t检验，4种单体间抗RSV活性无显著性差异，P>0.05。将4种单体在2～128 g/ml 范围内的抗RSV抑制率与阳性对照药物相比，经t检验，P<0.01，有显著性差异，大青叶单体的体外抗RSV优于病毒唑和抗病毒口服液。

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