正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆

【摘要】  目的 获得骨形态发生蛋白（BMP?9）基因并进行基因读码框架的克隆。方法 自正常成人肝组织提取总RNA，一步法RT?PCR扩增BMP?9，扩增产物经过胶回收及酶切后，克隆入高效真核表达质粒pcDNA4/HisMax，构建重组表达载体。结果 RT?PCR扩增获得约1.3 kb大小的产物，经限制性酶切分析和DNA测序，证实为人BMP?9基因的完整开放读码框架。重组载体表达读码序列正确。结论 正常成人肝组织总RNA经一步法RT?PCR，能够对BMP?9基因的开放读码框架进行完整有效的筛选。BMP?9开放读码框架的完整克隆为其在骨、内分泌和神经系统等多能作用的转基因实验研究提供了基础。 
【关键词】  骨形态发生蛋白质类 重组真核表达载体 逆转录聚合酶链反应
［ABSTRACT］ObjectiveTo clone BMP?9 gene in adult liver tissue and construct recombinant eukaryotic expression vectors.MethodsTotal RNA was extracted from  normal liver tissue of an adult, then open reading frame of BMP?9 was cloned by one?step RT?PCR. The PCR products (1.4 kb) were inserted into eukaryotic expression vector, pcDNA4/HisMax, to construct recombinant vector.ResultsAccording to restrictive analysis and DNA sequencing of recombinant vector, the open reading frame of BMP?9 was identified and the insert in MCS was correct.ConclusionThe ORF of BMP?9 gene can be screened effectively from total RNA of normal liver tissue by one?step RT?PCR. The complete clone of ORF of BMP?9 has provided the basis for multi?function gene transfer experiments in the fields of orthopedics, endocrinology and central nervous system.
    ［KEY WORDS］bone morphogenetic proteins; recombinant eukaryotic expression vector; reverse transcriptase polymerase chain reaction
    转化生长因子?β(TGF?β)超家族在细胞生长和分化中具有重要作用。TGF?β超家族中的一个特殊亚族由骨形态发生蛋白(BMPs)组成。这些二聚体蛋白的特性是在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力[1]。目前在BMP亚家族中已发现40个以上成员，不同的BMP分子通过Ⅰ、Ⅱ型受体在哺乳类动物体内的不同系统发挥生理作用[2]。BMP?9是BMPs亚家族的成员之一，人BMP?9基因位于染色体10q11.23，其成熟肽段包括110个氨基酸。除具有成骨活性之外，BMP?9还具有参与肝的糖代谢、影响神经系统胆碱合成和对造血干细胞双向调节的作用等。本研究利用逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）技术筛选BMP?9的全长读码框架，克隆入真核表达载体构建重组体，获得准确且高纯度的质粒载体，为BMP?9转基因实验研究提供基础。现将结果报告如下。
    1  材料与方法
    1.1  标本来源
    收集正常成人外伤性肝破裂修复术中切除的破裂肝组织，DEPC?PBS反复洗涤后备用。
    1.2  总RNA提取
    将肝组织反复剪碎后，使用QIAGEN公司生产的QIAamp RNA Blood Mini Kit 试剂盒，按操作手册步骤进行肝组织总RNA的提取。
    1.3  One?step RT?PCR扩增及PCR产物胶上回收
    根据人BMP?9在GenBank中的序列设计能扩增BMP?9完整开放读码框架的引物，并分别在上、下游引物5′端加入BamH Ⅰ 和Xba Ⅰ 酶切位点，上游引物：5′?CTCGGATCCATGTGTCC TGGGGCAC?TGTGG?3′，下游引物：5′?CTCTCTAGACTACCTGCACCCACACTCTGC?3′。RT?PCR反应体系为50 μL，内含：5×QIAGEN OneStep RT?PCR Buffer 10 μL；10 mmol/L dNTP 2 μL；5×Q?Solution 10 μL；上游引物（6 μmol/L） 5 μL；下游引物（6 μmol/L）  

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