杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取(3)

　　3.3  PCR验证以改良CTAB法提取的RNA进行反转录产物为模板，用18S A，18S B为引物进行PCR。实验结果表明，能成功地扩增出长度为110 bp左右的目的片段。这进一步说明本实验法提取的RNA样品完整，可以用于后续试验(见图2)。

　　3.4  杜鹃花 hsp70基因cDNA 核心片段的扩增采用简并引物C1和C2进行巢式PCR第1轮扩增仅得到模糊的条带，进一步采用内侧锚定简并引物D1和D2进行巢式PCR的第2轮扩增到1条约350 bp的DNA片段，与预计的目的片段相似（见图3）。回收后克隆至pMD18-T载体(TaKaRa)，转化感受态DH5α，利用D1、D2引物，将通过菌落PCR反应检测得到阳性克隆进行测序，得到366bp的cDNA片段。测序后通过NCBI上的BLAST工具分析，证实为hsp70基因序列。

　　4  讨论

    能否有效抑制RNase，去除多糖、酚叶片中含有大量的多酚，多糖，对RNA的提取方法提出了更高的要求。本实验采用CTAB(十六烷基溴化三甲胺)裂解植物材料，与细胞中的核酸形成核酸-CTAB复合体，这类复合物沉淀的时候将蛋白、多糖、色素以及多酚类化合物与核酸分离开来。利用水饱和酚可以部分去除DNA，获得DNA残留极少的RNA，减少DNA污染；同时，由于水饱和酚的加入，提高了去除蛋白质的效率，使得氯仿抽提次数在提取过程中减少，本实验中只需再进行一次氯仿：异戊醇抽提，就能使有机相与水相的界面清亮，彻底去除蛋白，避免了反复操作。
   
　　近年来已有关于去除植物组织多糖和酚类物质的相关报道，但不同植物或同一植物的不同品种往往因种属差异，材料组织内多糖或多酚的组分和含量有很大不同，所以需要采用不同的RNA提取方法。有研究表明，在高浓度Na+或K+的存在条件下，通过氯仿抽提可以去除一些多糖，经过本实验确定，与高浓度的KAc相比，高浓度的NaCl去除样品中多糖的效果更好，从而建立了有效提取样品RNA的方案。与传统CTAB法相比，本实验减少了用LiCl选择性沉淀RNA过夜的步骤，改为分级去除杂质，节省了试验时间，有利于减少RNA的降解和损耗，提高了样品的质量。
   
　　RNA plant试剂对于杜鹃花这种多酚，多糖含量都很高的材料，效果一般，可能多糖形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来［7］。本实验所用的药品、试剂都较为常用，采用该方法能在一天内完成RNA的提取工作，并得到质量很高的产品，相比购买市售的RNA提取试剂盒或传统CTAB法，具有花费少、易操作、耗时短、成效高的优点。

【参考文献】
  1］张玉进，孟祥春，潘瑞炽，等.非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进［J］.植物学通报, 2001, 18 (6):722.

　　［2］张今今，王跃进，王西平，等.葡萄总RNA提取方法的研究［J］.果树学报，2003， 20 (3):178.

　　［3］侯义龙，张开春，吴禄平，等.果树组织中总RNA提取的新方法［J］.沈阳农业大学学报,2002,33(2):122.

　　［4］A. da Silva Gesteira, F. Micheli, C. Fortes Ferreira. Isolation and purifcation of functional total RNA from diverse organs of cacao tree during its interaction with the pathogen Crinipillis perniciosa［J］. BioTechniques,2003, 35: 495.

　　［5］Jackola L, Pirttila A.M, Halonen M,et al. Isolation of high quality RNA from bilberry (Vaccinium myrtillus L)fruit［J］.Mol Biotechnology,2001,19:201.

　　［6］刘志，杨永华.CTAB法提取中草药材滇紫草细胞的总RNA［J］.生物技术通讯, 2004, 4: 372.

　　［7］Myeong-hyeon W,Hak-ik R. Improved technique for isolating RNA from tobacco tissues［J］. Plant Molecular Biology Reporter,2001,19:187

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