杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取

                 作者：郭秀莲，张正银，田萍，罗绍银，白洁，庄平

【摘要】  目的研究杜鹃花叶片总RNA的提取方法。方法一种适合富含次生代谢产物的杜鹃花叶片总RNA的提取方法——改良CTAB法。采用CTAB作为去污剂，分别用氯仿和水饱和酚反复抽提以及高浓度NaCl沉淀，以去除蛋白质、多糖和次生代谢物等杂质，最后用无水乙醇沉淀获得总RNA。结果该方法不仅使所获得的总RNA完整性好，纯度高，而且操作简单、快速、成本低廉。结论该方法对杜鹃花等富含次生代谢产物的植物特别是富含多酚、多糖的材料的总RNA提取具有借鉴意义。

【关键词】  RNA提取； 杜鹃花； 改良CTAB法

    ChinaAbstract：ObjectiveTo study the method for isolation of total RNA from Rhododendron leaf. MethodsAn improved CTAB method was presented here to be suitable for isolation of total RNA from Rhododendron leaf , a plant which contained abundant secondary metabolites. Using chemical CTAB as detergent in the extraction buffer, the absolute ethanol precipitation of RNA was performed finally after removing of proteins, polysaccharides, and secondary metabolites by subsequent chloroform, H2O-saturated phenol extraction and high concentration NaCl precipitation, respectively.ResultsThe yielded total RNA had integrality and high purity but. Conclusion The method may be applied to some difficult RNA extraction plants full of polyphenol and polysaccharides, particularly Rhododendron.

　　Key words： RNA extraction;   Rhododendron;   Improved CTAB Method
   
　　杜鹃花叶片中的蛋白质、多糖、多酚等次生物质含量多且复杂，严重影响了其RNA的提取质量，从而给此类植物的基因工程研究带来了诸多阻碍。由于多糖类胶状物质会严重堵塞过滤柱，所以即使使用商业提取试剂盒也不能得到高质量的RNA；另外，这类次生代谢物含量多的材料，市售的RNA提取试剂的针对性也不强，不仅操作麻烦费时，而且很难同时解决RNA的质量和得率问题。虽然目前已建立了很多针对富含多糖多酚材料的RNA提取方法［1～5］，但还没有以杜鹃花为材料提取RNA的报道。因此，本实验以杜鹃花叶片为材料，借鉴CTAB法［6］并进行了改良，提出一套适合提取杜鹃花叶片总RNA方法。

　　1  材料与仪器

　　1.1  试剂与仪器提取液配方：2%CTAB(W/V)，4%PVP(W/V)，100mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)，25 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)，5 mol·L-1NaCl，混匀灭菌121℃，15 min，灭菌后加入体积分数2%的2-硫基乙醇。 DEPC购自Amresco公司；琼脂糖购自Sigma 公司；rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa（大连）有限公司；引物由Invitrogen公司合成。其他试剂均为国产分析纯。
   
　　冷冻离心机：Centrifuge 5804 R(Eppendorf 公司)；电泳仪：DYY-Ⅲ 1型稳压仪(北京六一仪器厂)；紫外凝胶成像系统：Bio IMAGING SYSTEM(SYNGENE)；紫外可见分光光度计：TU-1800(北京普析通用仪器有限责任公司)；PCR 仪：Personalcycler (Biometra 公司)。

　　1.2  材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇淋，于-70 ℃贮存备用。

　　2  方法

　　2.1  几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总RNARNA plant试剂提取法：试剂购自TIANGEN公司，实验操作按照说明书进行；TRI Reagent 试剂提取法：试剂购自Ambion公司，实验操作按照说明书进行；RNeasy Plant Mini Kit试剂提取法：试剂购自QIAGEN公司，试验操作按照说明书进行。

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