杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取(2)

　　2.2  改良CTAB法提取程序：①称取100 mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入1.5 ml离心管内，加入65℃预热的0.75ml提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20 min。②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10min。③上清转入新的无RNase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5 mol·L-1 NaCl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑤上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，小心倒掉上清液；加入1 ml 70%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1离心1 min，小心倒掉上清液；加入30～50 μl DEPC处理水溶解沉淀。⑥加入DNase I(10 U·μl-1)1 μl混匀，37℃温浴30 min。⑦加入100 μl DEPC处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次 ，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑧吸上清液，加入1 ml无水乙醇， -20℃静置2 h。⑨4℃，12 000 r·min-1离心5 min弃上清液，用70%的乙醇洗涤。⑩4℃，12 000 r·min-1离心10 min弃上清，干燥后加入20μl DEPC处理水保存备用。

　　2.3  RNA完整性与质量检测使用各种方法提取时，样品的起始量均为100 mg，得到的RNA样品都稀释10倍后取1 μl进行非变性琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中观察提取的RNA完整性。取1 μl样品，稀释50倍，紫外分光光度计测量其在230 nm，260 nm，280 nm处的紫外吸光值(A)。计算A260 nm/A280 nm，A260 nm/A230 nm用于纯度分析。

　　2.4  RT-PCR按TaKaRa公司AMV反转录酶操作手册进行。合成一对克隆18S rRNA序列的引物18S A(5'-CAACCATAAACGATGCCGACC-3')和18S B (5'-CAGCCTTGCGACCAT ACTCCC-3')，以反转录产物为模板进行PCR扩增。扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s→63 ℃ 40 s→72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

　　2.5  杜鹃花 hsp70基因cDNA 核心片段的克隆根据已知植物hsp70基因核甘酸序列（mRNA）的保守区域设计合成下述4个正向或反向简并引物做巢式PCR。外测为C1: 5'-GGNATHGAYYTNGGNACN- 3'，C2: 5'- NCCNGCRTC YTTNGTNGC -3'；内测为D1: 5'-GAYCARGGNAAYMGNACNACNCC-3'，D2: 5'-RTCRTT RAARTANGCNGGNAC-3'。预期PCR产物片段大小为350 bp左右。以上述cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行巢式PCR扩增，以引物C1，C2进行巢式PCR的首轮扩增，反应体系为cDNA 1 μl 、10×PCR 缓冲液(无Mg2+)2 μl 、dNTP (2.5 mmol· L-1) 2.4 μl 、rTaq 酶0.25 μl (2 U·L-1)，以及C1、C2(100 mol·L-1)各1 μl，Mg2+（25 mmol· L-1）2.4 μl，加ddH2O 至20 μl。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，49 ℃ 50 s ，72 ℃ 1 min ，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 取首次扩增产物1 μl，稀释20 倍作为第2轮扩增的模板，用引物D1、D2进行巢式PCR的第二轮扩增，反应体系与巢式PCR的首轮扩增相同,扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s ，72 ℃1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

　　3  结果

　　3.1  RNA完整性分析通过琼脂糖凝胶电泳可以直观地看到（见图1），改良CTAB法提取的杜鹃花叶片总RNA，条带清晰，完整，不拖尾(泳道1，2)，说明在该方法中RNA很少降解。而RNAplant试剂提取的RNA (泳道3，4)，在初始加入材料量相同的情况下，条带较暗也就是得率较低。而TRI Reagent 试剂盒和RNeasy Plant Mini Kit 试剂盒均未能提取得到杜鹃花叶片总RNA。

　　3.2  RNA 完整性分析及质量检测用紫外分光光度计测量改良CTAB法得到的RNA样品的A260 nm、A280 nm和A230 nm值。经过多次实验的结果计算， A260/ A280平均约为2.02，A260/A230平均约为1.97。A260/A280和A260/A230比值均在许可范围内。在RNA得率方面，用100 mg鲜重的起始材料，可得到20 μg左右的总RNA。

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