1.1 动物与分组
成年Wistar大鼠33只,雌雄不限，体质量为180～240 g，由青岛市药物检验所动物中心提供。随机分为正常组（3只）、对照组（15只）、实验组（15只）。后两组根据灌注时间的不同再分为1、6、12、24、48 h组，所有动物均饲养在正常昼夜环境中。
1.2 主要试剂
TUNEL凋亡试剂盒、DAB显色试剂盒、SABC 试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Bax多克隆抗体和多聚赖氨酸购自北京博奥森生物技术有限公司，NRG?1β （纯度＞97%）由美国Morehouse School of Medicine公司生产。
1.3 动物模型的制备及药物干预方法
参照尹晓涛等[3]的方法制备Wistar大鼠RIRI模型。模型制备过程中用氧氟沙星滴眼液(泰利必妥，日本产)滴眼以保持角膜湿润及预防感染，同时保持大鼠肛温在37.0～37.3 ℃。在缺血完毕恢复再灌注初始，分别由左眼耳侧角巩膜缘进入玻璃体腔，实验组注入5 μL的NRG?1β，对照组注入5 μL平衡盐溶液，将针头停留约15 s后拔出，以防药液渗漏。
1.4 标本采集与处理
大鼠分别于再灌注后1、6、12、24、48 h活体取材。摘除眼球后，沿角膜缘切开角膜去除晶状体，随后立即将眼球置于40 g/L的中性甲醛液中固定，时间＞24 h。取出组织块行常规脱水、透明、石蜡包埋并切片，片厚 5 μm。
1.5 TUNEL及Bax免疫组化染色
用TUNEL法检测凋亡神经细胞，检测程序严格按试剂盒操作说明进行；免疫组化法进行Bax染色，DAB显色，苏木精轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察并照相。
1.6 统计学处理
采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[4]软件对数据进行处理两样本均数比较采用t检验。
2 结 果
光学显微镜下观察，细胞胞核中出现棕黄色颗粒为TUNEL染色阳性凋亡细胞。凋亡细胞出现在视网膜内核层(INL)及神经节细胞层(GCL),而外核层(ONL)几乎无阳性表达。正常组未见凋亡细胞，对照组缺血再灌注1 h后仅可见少量凋亡细胞,再灌注后6 h凋亡现象逐渐明显，12 h凋亡细胞数逐渐增多,并于24 h达到高峰,48 h开始下降。实验组再灌注各时间点视网膜神经节细胞凋亡数目较对照组均明显减少(t=2.57～6.25,P＜0.01)。见表１。正常大鼠视网膜Bax蛋白不表达，Bax蛋白在对照组缺血再灌注1 h有极少量表达，6 h组表达略明显,主要位于GCL,在12 h组表达增强，在24 h组达高峰,以GCL、INL染色最为明显，在48 h组Bax蛋白表达下降。实验组Bax蛋白在各时间点的表达较对照组均减少(t=3.84～11.97,P＜0.01)。见表２。表1 两组缺血再灌注不同时间点同侧眼神经节细胞凋亡数目比较表2 两组缺血再灌注不同时间点Bax蛋白表达比较
3 讨 论
视网膜作为神经组织,在缺血低氧环境中极易受损伤,同时，由于视网膜中央动脉是终末动脉,故极易发生缺血,并可迅速导致视网膜的严重损伤。所以，缺血性视网膜损伤在眼科疾病中很常见，原因包括视网膜血管阻塞性疾病、高眼压以及影响视网膜血流量的眼科手术等。视网膜组织在缺血时已发生了功能受损,但恢复血流灌注后并不能使功能障碍减轻,反而加重了组织损伤，具体表现为许多缺血性眼病病人在血液再通后，视网膜损伤更严重，视功能进一步下降。由于能造成永久失明等严重后果,视网膜缺血再灌注损伤已经成为近年来引起广泛关注的眼科课题。在视网膜缺血再灌注损伤中，细胞凋亡是INL和GCL细胞死亡的主要方式。大鼠视网膜缺血再灌注后GCL损伤的主要机制可能与Bax的表达失衡有关。
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