1.2 方法
1.2.1 胚胎大鼠大脑皮层神经细胞培养［1］：孕15～18 d Wistar大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，无菌条件下剖腹取出胎鼠，开颅取出大脑皮层放入预冷的DMEM培养基中，剔除软脑膜和血管，将脑组织移入含血清的DMEM培养基（含10%胎牛血清和10%马血清）的小烧杯中，用细口吸管反复轻轻吹打成细胞悬液，以200目不锈钢筛网过滤，并将滤液细胞数调至1×109个/L，接种于经0.01%多聚?L?赖氨酸过夜处理的细胞培养板中（24孔板接种1ml·孔-1，96孔板接种0.1 ml·孔-1），置37℃，5%CO2培养箱中培养。次日待细胞贴壁后换液1次以去除死细胞，以后每3～4天换液1次。细胞培养至第6天时，加入终浓度10 μmol·L-1阿糖胞苷以抑制非神经细胞的生长，18 h后换新的DMEM培养基继续培养。
1.2.2 缺氧缺糖对神经细胞的损伤［2］：取培养8～10 d的神经细胞，吸去原培养液，用无糖 Earle’s 液（mmol·L-1：NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgSO4 1.0，NaH2PO4 1.0，HEPES 2.4，pH 7.4）洗2遍，每孔加入含连二亚硫酸钠0.5 mmol·L-1的无糖Earle’s 液１ml（24孔板），0.1 ml（96孔板），置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。正常对照组用含葡萄糖10 mmol·L-1的Earle’s 液孵育。给药组在损伤处理前24 h及处理过程中均加入不同浓度的Ami（10-7、10-6、10-5mol·L-1）。
1.2.3 MTT微量自动比色［3］：缺氧缺糖损伤细胞后24 h，用MTT染色法测定细胞存活率。96 孔细胞培养板于终止培养前每孔加入10 μl MTT（终浓度为0.5 g·L-1），继续培养4 h后，吸去上清液，加入二甲基亚砜（dimethylsulphoxide，DMSO）100 μl溶解甲肷结晶，待其充分溶解后，用酶标仪测其OD值，检测波长为570 nm。细胞存活率（%）=100%×OD值/对照组OD值。
1.2.4 LDH和NO的测定：细胞经损伤处理后，收集培养上清液，按文献方法［4，5］，参照试剂盒说明书测定培养液中LDH活性、NO含量。
1.2.5 培养液中GSH?Px含量的测定：细胞经损伤处理后，收集培养上清液，按文献方法［6］，参照GSH?Px试剂盒说明书进行操作，测培养液中GSH?Px的含量。
1.2.6 神经细胞Hoechst33342荧光染色：培养的神经细胞加入终浓度为10 μg/ml的Hoechst 33342，在37℃孵育30 min，用1%多聚甲醛固定10 min。将长有细胞的盖玻片封片于载玻片上，于荧光显微镜下观察结果。计数200个细胞,计算凋亡率。
1.2.7 神经细胞bcl?2和bax免疫组化染色：按常规方法操作，抗bcl?2或抗bax一抗工作浓度1∶200。
1.2.8 数据处理方法：计量资料数据用x±s表示，统计处理用SPSS软件作F检验。
2 结果
形态学观察显示，大鼠前脑皮层神经细胞培养8～12 d后，胞体呈锥形或多极形，光晕明显，多聚集成团，细胞团之间可见粗大突起连接成神经网络，核不可见。经“缺血”损伤后，细胞突起缩短，胞体折光性下降，颗粒样物质增多。经Hoechst33342荧光染色，活细胞的核、浆呈弥散均匀荧光；凋亡细胞的核或细胞质内可见浓染致密颗粒、块状荧光和核裂解块状荧光。检测培养上清液，发现LDH漏出率、NO含量明显增加，GSH?Px活性明显降低。Ami 10-7、10-6、10-5mol·L-1能显著减轻缺血对神经细胞的损伤作用，用药组与损伤组相比，细胞更接近正常形态，细胞存活率、细胞含量增加，NO的生成受到抑制，GSH?Px活性明显增强，凋亡率下降，促进缺氧神经细胞产生bcl?2，并减少bax的产生。详见表1～3。表1 阿米替林对缺氧缺糖损伤神经元的影响 表2 阿米替林对缺氧缺糖损伤神经元NO、GSH?Px的影响（ 表3 阿米替林对缺氧缺糖损伤神经元凋亡率、bcl?2和 bax蛋白表达的影响
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