阿米替林对缺血损伤神经元bcl2和bax表达的影响

【摘要】  研究阿米替林(Ami)对缺血损伤神经元bcl?2和bax表达的影响。方法 分离培养 15～18 d胎龄的大鼠神经细胞，用连二亚硫酸钠消除培养基中的氧合并培养基缺糖模拟细胞缺血性损伤，测定乳酸脱氢酶、一氧化氮、谷胱甘肽过氧化物酶的含量变化，观察缺氧缺糖对神经细胞的损伤及Ami的保护作用，并使用Hoechst 33342荧光染色法、免疫细胞化学染色法观察Ami对原代神经细胞的抗凋亡作用。结果 缺氧缺糖引起神经细胞明显损伤性变化，存活率下降，凋亡率升高，培养上清液中乳酸脱氢酶、一氧化氮含量升高，谷胱甘肽过氧化物酶水平显著降低，促进缺氧神经细胞产生bcl?2，并减少bax的产生。Ami 10-7～10-5 mol·L-1能不同程度地减轻上述损伤性变化。结论 Ami对神经细胞“缺血”性损伤有保护作用，其抗凋亡机制可能与增加bcl?2表达，下调bax表达有关。 
【关键词】  阿米替林 神经细胞 缺氧 凋亡

    【Abstract】  Objective  To study the effects of amitriptyline(Ami) on expression of bcl?2 and bax in rats neurons after anoxia.Methods  The injury model of cultured neurons was made by the administration of sodium dithionite and glucose?deprived Earle’s solution. The protective effects of Ami in vitro analyzed with MTT reduction assay was observed by determining the content of nitric oxide(NO)by Griess reagent and the activities of lactate dehydrogenase(LDH) and glutathione peroxidase （eGSH?Px）by LDH and GSH?Px kits, respectively. The anti?apoptosis effect of Ami on primary cultured neurons was observed by methods of Hoechst 33342 staining and immunocytochemistry.Results  Ami (10-7，10-6，10-5mol·L-1)  dropped apoptosis rate of cerebral cortical neurons induced by hypoxia, increased bcl?2 protein expression and decreased bax protein expression.Conclusion  The results suggest that Ami is able to prevent hypoxic neurons from apoptosis in primary cultured cerebral cortical neurons. The effect of anti?apoptosis is through up?regulation of bcl?2 protein expression and down?regulation of bax protein expression.
    【Key words】  amitriptyline，neuron，hypoxia，apoptosis
    脑缺血损伤不仅可以引起神经元急性坏死，还可以导致迟发性神经元损伤。神经元损伤涉及多种因素，微循环障碍导致能量缺乏，氧自由基的大量产生，消耗了细胞中的抗氧化物质，引起或加重了脂质过氧化反应，兴奋性氨基酸释放增多引起细胞钙超载，最终致细胞坏死或凋亡。本研究利用培养大鼠皮层神经细胞，以连二亚硫酸钠（sodium dithionite）消除培养基中的氧合并培养基缺糖建立神经细胞“缺血”模型，观察其对神经细胞的损伤作用，通过测定培养液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,   LDH）活性、一氧化氮（nitric oxide, NO）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH?Px）含量观察其细胞保护作用，以Hoechst 33342荧光染色法、免疫细胞化学染色法观察其抗凋亡作用，并探讨其抗脑缺血作用的机制。
    1  材料与方法
    1.1  材料  孕15～18 d Wistar大鼠（滨州医学院实验动物中心提供）。盐酸阿米替林、多聚?L?赖氨酸（分子量为150 000～300 000）、噻唑兰（3?［4,5?dimethylthiazoyl?2?yl］?2,5?dipenthyl?tetrazolium bromide，MTT）、Hoechst 33342（均为Sigma公司产品）；DMEM高糖培养基、胎牛血清、马血清（均为Gibco公司产品）；连二亚硫酸钠（sodium  dithionite）（天津石英钟厂霸州化工分厂）；盐酸阿糖胞苷（cytarabine  hydrochloride）（上海华联制药有限公司）；LDH、NO、GSH?Px试剂盒（均为南京建成生物工程研究所产品）；总蛋白试剂盒（北京中生生物工程高技术公司）；抗兔IgG二抗ABC试剂盒（华美生物，即用型）；兔抗大鼠bcl?2和bax多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc）。其余试剂均为市售分析纯。HERA cell 二氧化碳培养箱（德国GmbH公司）；SW?CJ?1F型净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司；BH?NIC?B型倒置显微镜（日本Olympus Optical 公司）；722型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；DG5031型酶联免疫检测仪（华东电子管厂）。

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