基因组专题作业

题目： 假如你发现一个新基因，请利用基因组学的思路，方法，技术路线设计可行的实验方案，研究它的功能，寻找出它所影响的下游基因，可能与此蛋白相互用的其它蛋白，以及调控它表达的上游基因。

假如在哺乳动物林麝基因组中发现一个新基因，现在要对发现的新基因进行功能研究，主要从以下几个方面进行（张岚等， 2011；卜友泉等，2006）： 1． 通过生物信息学的方法对新基因进行结构及功能的预测

（1）在研究新基因的功能之前，首先要通过克隆试验得到新基因全长cDNA序列。所有的克隆都包括4个步骤，依次为产生DNA片段、连接至载体、转化到受体细胞中扩增和目的序列的筛选鉴别（张岚等，2011）。随着生物信息学的发展，目前还有一种电子克隆的方法，即将所发现的新基因EST 通过数据库比对，相同的unigene或 cluster的EST片段归类在一起，对其进行拼接和校对，尽可能延长获得的片段，最后获得全长cDNA （张丽娟等，2006）。

基因区域的预测（张丽娟等，2006）通过生物信息学的方法，主要从以下几个方面：

一、 对编码区进行统计特性分析。统计数据表明，DNA中密码子的使用频

率并非平均分布，某些密码子使用频率较高，编码区的序列呈现出可察觉的统计特性，即所谓的“密码子偏好性”。利用这一特性对未知序列进行统计分析可发现编码区的粗略位置。 二、 启动子分析。启动子分析的方法主要有位点比重阵列、隐马尔科夫模

型、神经网络原理、CpG 岛等几种方法。

三、 内含子/外显子剪接位点分析。 四、 翻译起始位点、终止信号分析。

（2）基因中的碱基序列决定蛋白质的氨基酸顺序，因此，通过生物信息学的方法还可以预测蛋白质的结构、性质及功能（张丽娟等，2006），初步了解基因的功能，为后面的实验验证打基础。

蛋白质的结构分为一级结构、二级机构及三级结构、一级结构即为蛋白质的氨基酸顺序，应用ExPASy工具包就可以预知该蛋白质的物化性质。同样的，应用nnPredict、PredictProtein、SOPMA可以预测蛋白质的二级结构，还可以用同源性建模和串线算法预测三维结构。在已知的数据库中，可以通过序列比对、确定序列的特性来预测新基因的功能（张丽娟等，2006）。 2． 通过试验方法进行基因功能的验证，包括功能策略和功能失活策略 对新基因功能进行合理的预测后，需要通过试验方法来验证。目前基因功能的研究策略为功能获得与功能失活。功能获得策略即通过将新基因直接导入某一细胞或个体中，通过观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因功能，常用的方法有基因转导、动物转基因技术、过表达技术等。功能失活策略

即通过观察某一细胞或个体在新基因的功能被部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基因的功能，常用的方法主要有RNA干扰、核酶技术、基因敲除、基因诱捕技术、人工染色体转导、miRNA 技术等（张岚等， 2011）。

基因转导是将目的基因转入某一细胞中，然后观察该细胞生物学行为的变化，从而了解该基因的功能。这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响，故要慎重选择转导系统。常用的基因转导系统有非病毒和病毒性两种。 2.1 目的基因克隆及表达蛋白亚细胞

目的基因克隆及表达蛋白亚细胞的主要实验步骤如下（刘惠君， 2010）： （1） 提取总RNA，然后通过RT- PCR获得cDNA，测序分析 （2） 提取不同组织的cDNA，进行表达谱分析

（3） 将获取的cDNA与增强型荧光表达载体双酶切 （4） 然后将经过酶切与纯化的目的片段和载体片段进行连接反应（重组） （5） 然后将连接反应产物转入感受态细胞（重组质粒转化），

（6） 然后将感受态细胞在具有抗性抗生素的培养基培养，筛选阳性克隆 （7） 挑选阳性克隆，鉴定、测序，质粒粗提

（8） 重组质粒转染，同时以空白细胞和空载体转染细胞对照。 （9） 激光共聚焦显微镜成像，观察蛋白在亚细胞中的定位。 （10） 观察细胞行为的变化，了解功能 2.2 新基因转录调控相关研究

通过genome walking PCR寻找该基因的启动子等转录调控区域， 通过单杂交或ChIP等技术， 寻找该基因的转录调控蛋白。 2.3 基因编码产物相互作用蛋白的研究

基本功能的完成离不开蛋白质之间相互作用及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基于亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和近年来建立和广泛应用的酵母双杂交系统等（张岚等， 2011）。

酵母双杂交GAL4系统筛选cDNA文库实验流程： （1） 构建DNA-BD与钓饵DNA融合的重组质粒

（2） 构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母菌AH109 （3） 检测钓饵蛋白自身激活能力

（4） 文库DNA转化含有DNA-BD载体的酵母菌AH109 （5） 阳性克隆在X-α-Gal平板上的初步筛选 （6） 酵母中质粒的提取及PCR酶切分类

（7） 酵母质粒电转化大肠杆菌KC8，抽提分离所需质粒

（8） 所得质粒与构建于DNA-BD载体的目的DNA再次共转化酵母菌AH109

（9） 阳性克隆在X-α-Gal平板上的再次验证，质粒纯化、测序

2.4 个体水平的新基因功能研究

将新基因克隆转导小鼠体内，通过组织中新基因超表达及RNAi技术了解新基因的功能（贾浩，2012；袁婺州等，2002）。将果蝇作为模式生物，操作流程如下：

（1）双链RNA模板合成：将cDNA的PCR产物作为双链RNA合成的模板，在设计引物时，在每个引物的5′端都加了一段启动子序列让单一的PCR产物的两条链能在一个反应里同时合成。双链RNA的合成目前多有试剂盒可用。 （2）显微注射：采用转基因仪进行双链RNA的显微注射 （3）RNAi表型分析。 参考文献：

张岚, 李庆章. 新基因功能研究的整体策略. 中国畜牧兽医, 2011,38（5）：109 – 113. 张丽娟, 成军, 罗军. 新基因功能预测的理论及方法. 医学分子生物学杂志, 2006, 3 （4）：279 – 282.

卜友泉, 杨正梅, 宋方洲. 新基因功能研究的策略与方法. 生命科学研究, 2006,10（2）：95 – 107.

刘惠君. 新基因BRAP的克隆与功能研究. 中南大学硕士学位论文. 2010. 贾浩. 猪HOXA11 基因转录调控研究. 华中农业大学硕士学位论文. 2012.

袁婺州, Bodmer R, 朱传炳, 李永清, 吴秀山. 利用RNAi 技术研究果蝇心脏发育基因的功能.遗传学报, 2002, 29 (1): 34 – 38.

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