比色法测定可溶性糖、果胶、半纤维素、纤维素含量

比色法测定可溶性糖、果胶、半纤维素、纤维素含量

标准液配制

1、1.00mg/mL葡萄糖标准液：秤取干燥至恒重的葡萄糖100mg，加水溶解定容至100mL，混匀。

2、1.00mg/mL木糖标准液：秤取干燥至恒重的木糖100mg，加水溶解定容至100mL，混匀。

3、1.00mg/mL半乳糖醛酸标准液：秤取干燥至恒重的半乳糖醛酸100mg，加水溶解定容至100mL，混匀。

试剂配制：

1、0.5M 磷酸buffer（pH7）：7.01g K2HPO4·3H2O、2.61g KH2PO4溶于100mL蒸馏水。

2、0.2% 蒽酮试剂：0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸。

3、A试剂：6g 苔黑酚（6.87g C7H8O2·H2O）溶于100mL 无水乙醇。 B试剂：0.1g FeCl3 （0.17g FeCl3·6H2O）溶于100mL 37% 浓盐酸。 4、四硼酸钠/硫酸溶液：0.5g Na2B4O7溶（0.95g Na2B4O7·10H2O）于100mL 浓硫酸。

5、1.5mg/mL 间羟基联苯溶液：0.15g 间羟基联苯（3-phenylphenol）溶于100mL 5mg/mL NaOH。

6、氯仿-甲醇（1：1，v/v） 7、DMSO-H2O（9：1，v/v）

操作步骤

样品65℃烘干3天，打碎。

1、磷酸 buffer 提取可溶性糖 (研磨)

（1）将已过40目筛的样品在50°C 条件下烘干。混匀，平行称取6 份 0.1000g（左右） 干重样品于15 ml离心管中。

（2）加入 5 ml pH=7的0.5M磷酸 buffer，50°C 摇2 h, 2100 g 离心10 min,。

（3）收集上清于50 ml离心管中。沉淀再用 5 ml buffer洗2 次，5 ml蒸馏水洗2 次 。收集所有上清于50 ml离心管中，定容测定C5、C6。

2. 氯仿-甲醇（Chloroform-methanol）提取脂类

（1）于沉淀中加入5 ml氯仿-甲醇（1：1 v/v）, 用封口膜密封，在摇床中40°C（150转）振荡1 h,。

（2）离心（4000rpm 10min）, 去掉上清液。于沉淀中加入5 ml甲醇洗1次.，再用5 ml 丙酮洗1次，再用5 ml蒸馏水洗1 次，去掉上清液。

3、DMSO提取淀粉

（1）于沉淀中加入5 ml DMSO-H2O（9：1 v/v），用封口膜密封，vortexing 3 min, 在摇床中（100转）轻轻振荡过夜。

（2）离心（4000rpm 10min）, 去掉上清液，沉淀用5 ml DMSO-H2O 洗2 次, 再用5 ml 蒸馏水洗3 次。

4、草酸铵提取果胶质

（1）于沉淀中加入5 ml 0.5% 草酸铵, 在沸水中加热 1h,每隔10 min 摇匀，以免溶液表面的堆集。

（2）沉淀（4000rpm 10min）再用5 ml 0.5% 草酸铵洗1 次, 5 ml 蒸馏水洗2 次 ，收集所有上清，定容，测定C5、C6。

5、4M KOH 提取半纤维素

（1）于沉淀中加入5 ml 4M KOH （内含1 mg/ml 的NaHB4）, 在室温下提取1 h, 在这期间每隔10 min 轻轻摇动。

（2）离心（4000rpm 10min）, 沉淀再用5 ml 4M KOH 洗1 次，5 ml 蒸馏水洗2 次 ，收集所有上清，定容，测定C5、C6。

6、乙酸-硝酸-水 提取半纤维素

于沉淀中加入5mL乙酸-硝酸-水（8:1:2，v/v/v），沸水浴1h（每10min 涡旋一次），离心（4000rpm 5min），沉淀再用5mL ddH2O洗2次，去掉所有上清。

7、蒽酮法测纤维素

在纤维素沉淀中加入4mL 67% 硫酸，涡旋，25℃ 摇床150rpm 振荡1h，加水至10mL ，离心（4000rpm 10min），沉淀再用10mL ddH2O洗2次，收集所有上清，定容至100mL， 蒽酮比色测定C6。

C5、C6、糖醛酸含量测定 1、C6测定

（1）葡萄糖标准曲线制备

取1.00mg/mL 葡萄糖标准液10.0mL 加蒸馏水定容至100mL，再分别取0.2mL/0.4mL/0.6mL/0.8mL/1mL 补水至1mL，加入2mL 2%蒽酮试剂快速摇匀，沸水浴5min，自来水冷却，以1mL蒸馏水为空白对照620nm比色。

（2）可溶性糖提取液、果胶提取液及空白对照（空白对照为提取液）摇匀后各取1mL比色。

（3）半纤维素提取液摇匀后取0.1mL，加入0.1mL 2M HCl中和，再加入0.46mL 无水乙醇，摇匀，离心去上清，沉淀中加入1mL蒸馏水比色。

（4）取0.2mL纤维素提取液加入0.8mL蒸馏水比色。 2、C5测定

（1）木糖标准曲线制备

取1.00mg/mL 木糖标准液10.0mL 加蒸馏水定容至100mL，再分别取0.2mL/0.4mL/0.6mL/0.8mL/1mL 补水至1mL，先加入134uL A试剂，再加入2mL B试剂，混匀，沸水浴20min，自来水冷却至室温，1mL 蒸馏水做空白对照660nm比色。

（2）可溶性糖提取液、果胶提取液及空白对照（空白对照为提取液）摇匀后各取1mL比色。

（3）半纤维素提取液摇匀后取0.1mL，加入0.1mL 2M HCl中和，再加入0.46mL 无水乙醇，摇匀，离心去上清，沉淀中加入1mL蒸馏水比色。

3、糖醛酸测定

（1）半乳糖醛酸标准曲线制备

取1.00mg/mL 半乳糖醛酸标准液10.0mL 加蒸馏水定容至100mL，再分别取0.2mL/0.4mL/0.6mL/0.8mL/1mL 补水至1mL，加入5mL四硼酸钠/硫酸溶液，混匀，沸水浴20min，自来水冷却至室温，1mL 蒸馏水做空白对照520nm比色。再加入100uL 1.5mg/mL 间羟基联苯溶液，混匀，5min后520nm再读一次，吸光度的增加表示糖醛酸的含量。

（2）果胶提取液及空白对照（空白对照为提取液）摇匀后取1mL比色。

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