土壤中微生物的分离与纯化

实验五土壤中的四类微生物的分离与纯化

（一）实验目的

1.明确培养基的配制原理，并通过对微生物培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤

2.掌握按照研究需要选取不同的环境以找到自己需要的目标菌株的基本方法，学习分离纯化微生物的基本操作技术。进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法以及接种技术。

3.学习并掌握放线菌、霉菌、酵母菌形态结构的方法。 4．加深理解放线菌、霉菌、酵母菌形态结构特征 （二）实验原理 1.土壤中存在微生物

土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离，纯化到许多有用的菌株。

土壤中含有多种多样的有机和无机营养物，所以被称为微生物生长和繁殖的天然培养基。土壤的环境条件十分复杂多变，其中的微生物种类也极其丰富，1g干的农田土壤中含有几百万个细菌，数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类。 2.富集培养

指从微生物混合群开始，对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法。在适于目标微生物而不适于其他微生物生长的条件下继续培养，则目标微生物将成为优势种而得到纯培养。

3.微生物对营养物质的需求不同

微生物需要各种各样的营养物质，其功能主要有：提供能量，提供合成原料，调节代谢活动进行，提供适宜代谢环境。虽然微生物对各种营养物质需求不同，但是都离不开碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐，水。除水外，碳源所需的量最大，其次是氮源。在自养微生物中，能源是日光能或还原态无机物，在异养微生物中，能源就是碳源。在无机盐中，磷，硫需量稍大，钾，镁次之。其他元素和生长因子的需要量一般很少。

4.微生物的生长速度不同

一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，会不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式不断进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过异化作用，则其原生质的总量就不断增加，于是出现了个体细胞的生长。在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义。影响微生物生长的主要因素：温度，Ph和氧气。 5.微生物在土壤中的分布概率不同

一般情况下，土壤中真菌的生物量和细菌的生物量几乎相等，而与真菌和细菌生物量相比，原生动物和藻类的生物量会少一个数量级。细菌（×108）>放线菌（×107）>霉菌

（×106）>酵母菌（×105）>藻类（×104）>原生动物（×103）由上可知，土壤中所含的微生物的数量很大，尤以细菌最多。土壤微生物的代谢活动可改变土壤的理化性质，促进物质转化，因此，土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。

本实验通过10倍稀释以及平板分离，平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落，挑取单个菌落接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 （三）实验器材 1.实验仪器

高压灭菌锅，超净工作台，普通光学显微镜，培养皿， 移液管（1ml），电子称量计，灭菌的袋子，小铲，500ml三角锥形瓶，250ml三角锥形瓶，250ml烧杯，药勺，无菌培养皿，盛9m1无菌水的试管6支、盛45m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃珠、接种环、酒精灯、称量纸，显微镜，载玻片，盖玻片，塑胶滴管，镊子，香柏油等 2.实验试剂

培养基的配料参照表1，香柏油，二甲苯，结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液，蒸馏水 （四）实验方法 1．取样 （1）土壤取样

根据实验的目的选取采样地点，把采到的土壤装进取样袋后直接带回微生物实验室立即使用或放入4℃的冰箱备用，但放置时间不要超过一天。 本实验采用的土壤为：大学城广工的土样 （2）水果样品

去南亭收集一些烂水果，最好有酒味的散发出来的。 2.培养基的制备 培养基的类别 查氏葡萄糖培养基 NaNO30.6g; K2HPO4 0.3g MgSO40.15g; KCl 0.15g; FeSO40.003g; 琼脂 6g 水 300ml,： 葡萄糖 9g 将配料烧杯中，最后加水至; 300mL，将其中200ml加入到500ml的烧瓶中，加4g琼脂；剩下100ml加入到250ml的烧瓶中，加2g琼脂，分装完毕后， 121℃高压灭菌20min。 酵母菌 培养基配制原料 配置方法 用于培养的菌种

NaNO3 0.6g; K2HPO4 0.3g ; MgSO4 0.15g; KCl 0.15g; FeSO4 0.003g; 琼脂： 6g 水：300ml,： 蔗糖：9g 高氏1号培养基 可溶性淀粉 0.6g， KNO3 0.3g, NaCl 0.15g, K2HPO4·3H2O 0.15g, MgSO4·7H2O 0.15g, FeSO4·7H2O 0.003g, 琼脂 6g 水 300mL 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏1.5g， 蛋白胨3g， NaCl1.5g, 琼脂6g， 水300ml 先将淀粉溶入烧杯中加热搅拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至300mL，将其中200ml加入到500ml的烧瓶中，加4g琼脂；剩下100ml加入到250ml的烧瓶中，加2g琼脂，分装完毕后， 121℃高压灭菌20min。 先将牛肉膏、蛋白胨溶入烧杯中加热搅拌至完全溶解，再加入其他成分依次溶解，最后加水至300mL，将其中200ml加入到500ml的烧瓶中，加4g琼脂；剩下100ml加入到250ml的烧瓶中，加2g琼脂，分装完毕后，121℃高压灭菌20min。 3.仪器灭菌

将配置好的培养基，用报纸包扎好的培养皿、用橡胶塞封好的盛有9mL的试管、枪头和装有45mL蒸馏水与玻璃珠的三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。 4．微生物的分离

（1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、查氏培养基溶化，待冷至55—60℃时，分别倒平板，其中其方法是右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果三角烧瓶内的培养基一次可用完，则瓶塞不必夹在手指中。瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约20ml，加盖后轻轻摇动培养皿，培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。

（2）制备土壤稀释液 称取土样5g，放入盛45ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散,配制成10?1土壤溶液。用一支1ml

细菌 放线菌 查氏蔗糖培养基 将配料烧杯中，最后加水至300mL，将其中200ml加入到500ml的烧瓶中，加4g琼脂；剩下100ml加入到250ml的烧瓶中，加2g琼脂，分装完毕后， 121℃高压灭菌20min。 霉菌

无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10?2，10?3，10?4，10?5，10?6各种稀释度的土壤溶液。 （3）分离微生物 分离细菌

划线 将牛肉膏蛋白胨两个平板底面分别用记号笔写上10?5和10?6两种稀释度，然后用接种环分别在10?5和10?6三管土壤稀释液中各吸取一环土壤稀释液，在平板上划线 。 培养 牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养3-5日。 分离放线菌

涂布 将高氏1号两个平板底面分别用记号笔写上10-4和10-5两种稀释度，然后用两支1ml无菌吸管分别由10-4和10-5两管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，加入8个灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。

培养 平板倒置于28℃温室中培养3—4日。 分离酵母与霉菌

涂布 将查氏四个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀释度（一个稀释度两皿），然后用两支1ml无菌吸管分别由10-3和10-4两管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，加入8个灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠倒出。放于30℃的培养箱中。其中查氏葡萄糖的培养1-2天后，取出挑菌。查氏蔗糖培养3-4天后挑菌。 （4）挑菌

划线分离 使用接种环从待纯化的菌落中沾取少量菌种，细菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上、霉菌和酵母菌在查氏培养基上、放线菌在高氏1号培养基上进行划线分离。 （5）保存菌种

将分离好的细菌放入37℃的培养箱中，酵母菌，霉菌和放线菌放到30℃培养箱中。待显微镜观察。

（6）用显微镜观察菌落 ①放线菌的观察 直接观察法

用镊子连同培养基挑取放线菌菌苔置载玻片中央。放在洁净的载玻片上，选择菌苔边缘部位，在显微镜下依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜直接观察，观察时需不断调节微调，仔细观察气生菌丝，基内菌丝和孢子丝的形状。 ②霉菌的观察

用镊子连同培养基挑取放线菌菌苔置载玻片中央。放在洁净的载玻片上，选择菌苔边缘部位，在显微镜下依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜直接观察，观察时需不断调节微

调，仔细观察菌丝，分生孢子梗和分生孢子。可加番红染色，观察得更加清楚。 ③ 酵母菌的观察 采用革兰氏染色法 ④细菌的观察 采用革兰氏染色法 附：革兰氏染色方法 （1） 涂片 常规涂片法

取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 （2） 初染

滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 （3） 媒染

用卢戈氏碘液媒染约1 min ，水洗。 （4） 脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 （5） 复染

在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。 （6） 镜检

干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。 （六）实验结果与分析

四大类微生物在个体和菌落上的主要区别： 细菌 酵母菌 放线菌 霉菌

细胞形态的区别 小而分散 大而分散 细丝状 粗丝状 菌落形态的区别 表面湿润，小而薄 表面湿润，大而厚 表面干燥，小而致密 表面干燥，大而蓬松

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