大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究(2)

　　2.2  DAPI染色的染色体DNA的形态分别收集大蓟总黄酮处理细胞和未用药的细胞用定色剂（甲醇∶乙酸为3∶1）染色10 min，10 min后用PBS冲洗，细胞再用DAPI液（1 μg溶解在1ml PBS中），然后用固定液固定，染色体DNA的形态在荧光显微镜下观察。

　　2．3  DNA琼脂糖凝胶电泳分别收集大蓟总黄酮和顺铂处理细胞1×105 个，按酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀等常规方法提取细胞总DNA，2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察DNA条带。

　　3  结果

　　3.1  MTT法测试结果用剂量12.5～200 μg /mg的大蓟总黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞48h后，MTT法测定大蓟黄酮对癌细胞的抑制作用（见图1）。从图1可以看到，对SMMC-7721和Hela细胞的IC50分别为93.64 μg/ml和85.12 μg/ml，同空白对照组比较差异极显著（P<0.01）。当用剂量12.5～200 μg /mg的大蓟黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞1，2 d或3 d后，对肿瘤细胞的生长（见图2），从图2可以看到，活细胞数随着大蓟黄酮浓度的增加而减少。研究结果表明大蓟黄酮对SMMC-7721和Hela细胞的抑制呈剂量和时间依赖性。用大蓟黄酮处理时间越长或剂量越大，对肿瘤细胞的抑制效果就越明显。

　　3.2  琼脂糖凝胶电泳结果琼脂糖凝胶电泳结果见图3，从 DNA电泳图（图3）上可以看到，癌细胞经100 μl/ml的大蓟总黄酮处理培养72h后，出现大小约为180～200 bp 整数倍的 DNA梯形断裂条带，而空白对照组细胞DNA提取物经琼脂糖凝胶电泳后只检测到一条总DNA条带。Hela细胞用100 μl/ml的大蓟黄酮处理培养72h后，出现大小约为180～200 bp 整数倍的 DNA梯形断裂条带(图3-A)。lane 3 为阳性对照（Hela 细胞用 0.1 μM taxol处理 4 h (图3-A)。图3大蓟总黄酮对SMMC 的电泳图。癌细胞经100 μl/ml的大蓟总黄酮处理培养72 h后，同样出现大小约为180-200 bp 整数倍的 DNA梯形断裂条带(图3-B， lane 4).研究结果表明大蓟黄酮能诱导SMMC-7721和Hela细胞凋亡。

　　3.3  DAPI 染色观察肿瘤细胞凋亡的特征凋亡的另一个特征是用DAPI 染色观察染色体DNA 的形态， 图 4(A) 为未处理的Hela细胞 染色体DNA，图4(B)是用大蓟总黄酮100 μl/ml处理 24 h后的Hela细胞 染色体DNA。Hela细胞在空白对照中出现分散的染色体DNA，图3(A)，而用药物处理后Hela细胞的染色体DNA明显的随处理时间而改变，24 h 后, 染色体 DNA 在核膜附近浓缩成一个或几个明显的小体，图4(B)。图4(C～D) 为处理和未被处理的SMMC细胞染色体DNA 形态的变化，其凋亡特征也能观察到。

　　4  讨论

    细胞凋亡是人体保持某一细胞群生存与死亡平衡的生理机制。它参与调节机体的发育、细胞的分化,体内正常细胞的更新和异常细胞的清除。普遍认为它与分裂、细胞分化类似，是一个级连式(Cascade)基因表达的结果,受许多因素的调控［4］。如果这一调控发生异常则会导致包括肿瘤、自身免疫病、神经系统疾病以及AIDS等许多疾病的发生。细胞凋亡的典型特征是:细胞凋亡过程中,被激活的核酸内切酶可有规律地将凋亡细胞DNA在两核小体间切断, DNA凝胶电泳时形成了特征性的DNA阶梯。形态上则表现为染色质固缩为不均一点状结构。细胞凋亡的另一显著特征是凋亡过程中交联细胞蛋白酶(transglutaminant)等的信号途径被激活,致使细胞浆浓缩形成的具有完整细胞膜包裹的凋亡小体(Apobody),电镜下,表现为凋亡发生早期,凋亡小体内含有正常形态的线粒体等细胞器［5］。

    大蓟总黄酮能诱导人肝癌SMMC-7721细胞和人子宫癌Hela细胞的凋亡，通过MTT法检测，其对Hela细胞的IC50为85.12 μg/ml，对SMMC-7721细胞的IC50为93.64μg/ml。大蓟总黄酮诱导细胞凋亡，DAPI染色，显微镜下观察细胞核呈致密浓染的快状或颗粒状，与凋亡形态学改变相对应的生化学基础是细胞核小体连接处DNA被随机切成180～200 bp左右及其倍数的寡核苷片段，琼脂糖凝胶电泳可见典型的“梯形”带，大蓟总黄酮处理SMMC-7721和Hela细胞后，相差显微镜下观察，细胞体积缩小，核裂解，细胞出泡，形成凋亡小体（图4），细胞贴壁能力下降，逐渐从培养瓶壁上脱落下来，DAPI染色，显微镜下观察细胞核呈致密浓染的快状，DNA电泳可见典型的“梯形”带（图3 A、B）。说明SMMC-7721和Hela细胞经大蓟总黄酮处理后发生了凋亡特征性改变。

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