蝎毒多肽提取物对白血病小鼠E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响(2)

　　2  方法

　　2.1  外周血中CD49d表达的检测取100 μl外周血加入流式管底部，加入0.5 μl FITC标记的CD49b抗体，涡旋使其与外周血混匀，避光孵育30 min，加A液，用流式细胞仪检测。

　　2.2  外周血中CXCR4表达的检测取40 μl外周血加入流式管底部，加入1 μl（1 mg/ml）的未标记的抗小鼠的CXCR4抗体，涡旋使其与外周血混匀，避光孵育30 min，用2 ml的PBS重悬细胞，800 r·min-1离心5 min，洗涤两次，洗去未结合的一抗，加FITC标记的二抗0.1 μl，避光孵育30 min，800 r·min-1离心5 min，去上清，PBS洗涤两次，加入A液，再加500 ml PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。

　　2.3  免疫组化小鼠处死后取肝脏，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，65℃烤片4 h。二甲苯脱蜡。梯度酒精水化后，在蒸馏水中浸泡5 min。0.01 mol/L PBS（pH=7.4）浸泡5 min/次，3次。加50 μl 过氧化酶阻断剂，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。0.01  mol/L PBS浸泡5 min/次，3次。0.01 mol/L柠檬酸盐抗原修复液，微波炉最低档抗原修复20 min。加50 μl 正常羊非免疫血清，室温下孵育30 min。加50 μl一抗，37℃孵育60 min。0.01 mol/L PBS浸泡5 min/次，3次。加50 μl二抗，37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS浸泡5 min/次，3次。加50 μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液，37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS 浸泡5 min/次，3次。加100 μl新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察5～30 min。苏木素复染，脱水、中性树胶封固。

　　2.4  免疫组化诊断标准阳性定位 ,E-钙黏蛋白表达主要定位于细胞浆上，细胞浆出现清晰棕黄色为阳性。每张切片分别观察10个高倍镜视野，每个高倍视野计数100个细胞数，计算出每张切片的阳性细胞百分数。

　　2.5  统计学分析数据用±s表示，多组间比较，用t检验。全部数据用SPSS13.0统计软件协助处理。

　　3  结果

　　3.1  各组CD49d表达水平的比较见表1。表1  各组CD49d表达水平的比较（略）

    各治疗组与模型组比较，有显著性差异（P＜0.01）。PESV低剂量组和高中剂量比较有显著性差异（P＜0.01），中高剂量之间没有差异（P＞0.01）。空白组与各治疗组相比，与PESV低剂量组有显著统计学差异（P＜0.01），与中剂量组有统计学差异（P＜0.05），与高剂量组无统计学差异（P＞0.01）。见图1～4。        

　　3.2  各组CXCR-4表达水平的比较见表2。表2  各组CXCR-4表达水平的比较（略）

    各治疗组与模型组比较，其中PESV低剂量组与模型组没有差异（P＞0.01），中高剂量组与模型组比较有差异（P＜0.05）。各治疗组与空白组比较，其中低中剂量组与空白组有显著差异（P＜0.01），高剂量组与空白组没有显著差异（P＞0.01）。见图5～8。   

　　3.3  各组E-钙黏蛋白表达水平的比较见表3。表3  各组E-钙黏蛋白表达水平的比较（略）

    各治疗组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），PESV低中剂量组比较有统计学意义（P＜0.05），高剂量与低中剂量比较有显著性差异（P＜0.01），高剂量与空白组比较有统计学意义（P＜0.05）。见图9～12。

　　4  讨论

    急性白血病的髓外浸润和转移是影响临床化疗和预后的重要原因，因此预防和治疗白血病髓外浸润成为了提高白血病临床疗效，延长患者生存时间，以及改善患者生存质量，防止复发的关键。目前关于中药预防白血病复发、髓外浸润的研究逐渐增多，如砷制剂、雄黄、蝎毒等。贾莉等［4～6］通过实验证明蝎毒可明显地抑制人B淋巴细胞株Raji、人早幼粒白血病细胞株HL-60、人红白血病细胞株K562细胞的生长并诱导其凋亡，本课题的前期研究证实全蝎具有诱导人白血病HL-60程序性死亡的作用［7,8］。本实验研究发现PESV对白血病小鼠的黏附因子CD49d、CXCR4和E-钙黏蛋白表达有明显的调节作用。

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