虎眼万年青总皂苷对诱发大鼠肝癌病变过程中肝组织IGF-2及P16ink4(3)

   
　　步骤1配置的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
   
　　Beta-actin（双向引物序列F:5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3' R:5'GTACTCCTGCTTGCTGATCC3' 退火温度(℃) 59产物长度(bp) 211）： 95℃，3 min；40个PCR循环［95℃，15 s；59℃，20 s；72℃，20 s；83℃（收集荧光），15 s］。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95℃，2 min；61℃，20 s；72℃，20 s；99℃，10 s，并从72℃缓慢加热到99℃（8 min）。见图2。
   
    IGF-2［双向引物序列: F5'GCCATTTGGAACATTGGACAG 3'  R:5'TCCCACGAGGCATATTAACACT 3'退火温度(℃)60产物长度(bp)149］： 95℃，3 min；40个PCR循环［95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；79℃（收集荧光），15 s］。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95℃，2 min；61℃，20 s；72℃，20 s；99℃，10 s，并从72℃缓慢加热到99℃（8 min）。见图3。
   
    p16Ink4a（双向引物序列F:5'ACCAAACGCCCCGAACA 3'R:5'GAGAGCTGCCACTTTGACGT3'退火温度(℃)60，产物长度(bp)76）： 95℃，3min；40个PCR循环［95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；80℃（收集荧光），15 s］。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95℃，2 min；62℃，20 s；72℃，20 s；99℃，10 s，并从72℃缓慢加热到99℃（8 min）。见图4。
  
　　3  结果

    各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。实时定量PCR时各样品加样量均为1 μl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1 μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因beta-actin作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。见表1。表1  各组肝组织校正后1 μl中IGF-2及p16ink4a含量（略）
   
　　在IGF-2中，与模型组18周癌组织比较，*P<0.05；在p16ink4a中，与模型组18周癌组织比较，*P<0.05；而与治疗组癌组织比较P>0.05；治疗组癌组织与模型组18周癌组织间亦P>0.05

　　4 讨论
   
　　肝癌是由病毒、化学致癌物等多病因作用［3］，因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致癌变，经启动、促进、演变多阶段的发病过程，其中基因的调控和表达、多种生长因子的活性等均与肝癌的发生、发展密切相关［4］。
   
　　IGF-2在胎肝和新生儿肝脏中有大量表达，但出生后基因迅速降低直至关闭，肝细胞癌变IGF-2呈胚胎性过量表达，并具有强烈的致有丝分裂剂作用，参与肿瘤细胞增生及分化［5］。IGF-2为肝癌的一种缺氧诱导血管生成因子，肝硬变再生结节和肝癌细胞的快速分裂导致肝脏供血不足，造成局部缺氧状态，促使IGF-2合成增加，并作为血管活性因子，间接促进血管内皮生长因子的合成，刺激肝癌新生血管的形成；IGF-2在肝细胞癌变发生、发展中具有重要作用，可能为诱癌因素导致IGF-2基因异常激活和过量表达，促使具有高增殖活性状态的癌前肝细胞转化，最终导致肝癌发生［6］。
   
　　本研究以实时定量PCR法定量分析了二乙基亚硝胺诱发肝癌变过程IGF-2的表达与变化。结果显示癌变过程中肝组织中IGF-2含量逐渐增加，肝癌进展阶段肝癌组织中IGF-2表达水平明显增高，说明肝癌细胞的快速分裂导致肝脏供血不足，IGF-2表达水平急剧升高。虎眼万年青总皂苷在肝癌变前期对IGF-2表达水平作用不大，而至肝癌进展阶段，经虎眼万年青总皂苷干预的肝癌组织的IGF-2表达量明显低于模型组，说明虎眼万年青总皂苷抑制肝癌细胞的快速分裂。而虎眼万年青总皂苷干预的肝癌组织IGF-2表达水平高于癌旁组织，但无统计学意义，能否说明IGF-2主要是通过肝细胞癌自分泌方式表达其水平，有待进一步深入研究。

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