虎眼万年青总皂苷对诱发大鼠肝癌病变过程中肝组织IGF-2及P16ink4(2)

　　1.4  试剂及器材

　　TRIZOL试剂、无RNA酶的水、无RNA酶的糖原（Invitrogen life technologies）；氯仿、异丙醇、100%乙醇、乙酸钠、甲醛（上海化学试剂有限公司）；Tris-HCl、EDTA 、MOPS、溴化乙锭、2.5 mM dNTP混合液、100 bp DNA Ladder（华美生物工程公司）；RNA酶抑制剂；MMLV反转录酶；5xRT缓冲液（上海生工生物工程有限公司）。DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）；FeroTec Gradien PCR基因扩增仪（杭州大和热磁电子有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；ABI 7700 Realtime PCR仪（ABI）；引物设计软件：Primer 5.0。

　　1.5  统计学方法

　　全部数据采用 SPSS14 for Windows统计分析软件进行处理，进行t检验、方差分析。

　　2 方法

　　2.1  样品的RNA抽提

　　①每50～100 mg组织样品，加入1 ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆。②匀浆后样品于15～30℃孵育5 min。每1 ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 s后，15到30℃孵育2～3 min。4℃下12 000 r·min-1离心15 min。③将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30°C孵育10 min后，于4℃12 000 r·min-1离心10 min。④移去上清液，每毫升TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃ 7 500 r·min-1离心5 min。⑤去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10 min。获得的RNA溶液保存于-70℃。

　　2．2   使用样品的RNA进行cDNA合成

　　2.2.1  配制退火混合物RNA 2 μg，0.5 μg/μl Oligo（dT）18 1μl，加无RNA酶的H2O至总体积 10 μl混合液在70℃水浴3 min,降到37℃放置10 min。

　　2.2.2  RT反应液（5xRT缓冲液4μl，2.5mmol/L dNTP混合液4μl，RNA酶抑制剂1 μl，MMLV反转录酶1 μl，混合后37℃恒温1 min）。

　　2.2.3  加10 μl的RT反应液到10 μl退火混合物中，37℃水浴60 min，加热到95℃维持5 min。得RT终溶液即cDNA溶液，置冰浴待用。

　　2.3  合成的cDNA用于实时定量PCR

　　2.3.1   制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板

    针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：dNTP（2.5 mmol/L each）（2.5 μl）；10 × PCR缓冲液（2.5 μl）；MgCl2 溶液（1.5 μl）；Taq聚合酶（1U）；10 μmol的PCR特异引物F（1 μl）；10 μmol的PCR特异引物R（1 μl）；cDNA（1 μl）；加水至总体积为25 μl。轻弹管底将溶液混合，40个PCR循环（94℃，20 s；退火温度，20 s；72℃，30 s）；72℃延伸5 min。
   
　　将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定standard1的浓度为106，standard 2的浓度为105 ，standard 3的浓度为104，standard 4的浓度为103，standard 5的浓度为102，standard 6的浓度为10，standard 7的浓度为1。见图1。
  
　　2.3.2  进行Realtime PCR反应
   
　　几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：dNTP（2.5mM each）（2.5μl）；10x PCR缓冲液（2.5 μl）MgCl2 溶液（1.5 μl）；Taq聚合酶（1units）；Sybergreen（终浓度0.25×）；50X  Rox（0.5 μl）；10 μmol/L的PCR特异引物F（1μl）；10 μmol/L的PCR特异引物R（1 μl）；cDNA or DNA（1 μl）；加水至总体积为25 μl。轻弹管底将溶液混合，5000 r/min短暂离心。

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