1.2.2 PCR检测 参考文献[1]设计扩增 IL?18基因?607位点的特异性引物，2条特异性正向引物序列分别为5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAAT?TATTAC?3′和5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAA?TTATTAA?3′，共同反向引物序列为5′?TAACCT?CATTCAGGACT?3′，质控正向引物序列为5′?CTT?TGCTATCATTCCAG?3′。?137位点2条特异性正向引物序列分别为5′?CCCCAACTTTTACGGA?AGAAAAG?3′和5′?CCCCAACTTTTACGGAAG?AAAAC?3′，共同反向引物序列为5′?AGGAGGGC?AAAATGCACTGG?3′，质控正向引物序列为5′?CCAATAGGACTGATTATTCCGCA?3′。?607位点的PCR总体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.25 mmol/L 的dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.4 μmol/L，一种特异性正向引物0.4 μmol/L，共同反向引物0.8 μmol/L。扩增参数：首先94 ℃预变性4 min;然后94 ℃变性20 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共行7个循环;随后94 ℃变性20 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共进行35个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定等位基因频率。?137位点的PCR总体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.5 μmol/L，一种特异性正向引物0.5 μmol/L，共同反向引物1.0 μmol/L。扩增参数：首先94 ℃预变性2 min;然后94 ℃变性20 s，68 ℃退火60 s，共行5个循环;随后94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共进行25个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定基因型。
2 结 果
2.1 IL?18基因?607位点多态性电泳
每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，301 bp处为质控条带，196 bp处是A/C等位基因特异性扩增片段。部分标本?607位点多态性检测电泳结果如图1。标本①只有C等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，所以其基因型为CC;标本②～④的2管PCR产物电泳后均可观察到长196 bp特异性扩增片段，故其为CA基因型;标本⑤只有A等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，其基因型则为AA。
2.2 IL?18基因?137位点多态性电泳
图2为部分标本IL?18基因?137位点多态性电泳检测结果，每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，446 bp处为质控条带，261 bp处为G/C等位基因特异性扩增片段。标本②和④只有G等位基因处可观察到长261 bp特异性扩增片段，所以其基因型为GG;标本③和⑤在两管PCR产物电泳后均可观察到长261 bp特异性扩增片段，其基因型为GC;标本①只有C等位基因处可观察到长度为261 bp特异性扩增片段，其基因型则为CC。
2.3 两组IL?18基因?137G/C、?607C/A位点基因型频率和等位基因频率的比较
两组IL?18基因?137G/C、?607C/A位点基因型频率及等位基因频率比较，差异均无显著意义(P>0.05)。见表1、2。
2.4 两组血清IL?18水平的比较
PSS组病人和对照组的血清IL?18水平分别为(49.37±15.77)和(476.79±93.17) ng/L，两组比较差异有显著性(t=24.06,P<0.001)。
2.5 IL?18不同基因型病人血清IL?18水平比较
PSS组病人IL?18基因?607位点CC、CA、AA基因型的血清IL?18水平分别为(47.97±13.58)、 (951.41±9.6)、(48.97±9.36)ng/L，IL?18基因?137位点GG、GC、CC基因型的血清IL?18水平则分别为(50.05±9.97)、(48.16±11.60)、(52.80±0.00)ng/L，不同基因型间血清IL?18水平比较差异均无显著性(P>0.05)。见表2。
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