作者：朱新红 高美华 于新娟 林存智
【摘要】 目的 探讨野生型和突变型CD59分子的表达与细胞凋亡因子之间的关系。方法 应用免疫组化方法，分别测定空pIRES、野生型pIRES?WTCD59和突变型pIRES?MCD59转染CHO细胞中凋亡相关基因Caspase?3、Bcl?2的表达。结果 转染野生型pIRES?WTCD59组与转染空pIRES质粒组比较，Caspase?3表达降低，Bcl?2表达增高，差异有显著性（Z=3.462、3.958,P<0.05）；转染突变型pIRES?MCD59组与转染空pIRES质粒组比较，Caspase?3表达降低，Bcl?2表达增高，差异有显著性（Z=3.212、3.956,P<0.05）；转染野生型pIRES?WTCD59组与突变型pIRES?MCD59组比较，Caspase?3、Bcl?2表达差异无显著性（Z=1.948、0.544;P>0.05）。结论 CD59分子具有抑制凋亡的作用，而其保守位点W40与凋亡信号的传导无关。
【关键词】 抗原，CD59；点突变；Caspase?3；基因,bcl?2；细胞凋亡
CD59分子是一种广泛分布于各种组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇锚固型糖蛋白。近年来，国内外学者已在多种实体瘤细胞中，如子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤及肠道肿瘤等发现有CD59分子的过表达，并且其过表达与肿瘤细胞的失控性生长和恶性转化密切相关[1～4]。揭示CD59分子与细胞凋亡之间的相关性，可为深入研究实体肿瘤的免疫治疗开辟一条新的途径。本文从CD59分子的基因水平，构建野生型CD59与突变型CD59（点突变W40）真核表达系统，筛选稳定细胞克隆，检测转染细胞中凋亡相关基因Caspase?3、Bcl?2的表达，研究CD59与凋亡因子的相关性。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人CD59 cDNA由美国哈佛大学医学院提供,CD59 单克隆抗体(McAb)?FITC购自Coulter 公司; 羊抗人CD59 多克隆抗体购自SCB公司;辣根酶标记兔抗羊IgG购自北京中山生物技术有限公司;转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen 公司;Caspase?3、Bcl?2免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。
1.2 重组真核表达载体转染及表达
采用基因点突变技术使CD59 W40基因位置缺失,各设计两条互补突变引物和两条常规引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR(Overlap extension PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18?T?Vector, EcoRⅠ单酶切野生型和突变型CD59基因，重组入真核表达质粒pIRES[5],利用阳离子脂质体(Lipfectamine 2000) 将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 进行表达，将构建的野生型pIRES?WTCD59、突变型pIRES?MCD59、空质粒pIRES应用阳离子脂质体(Lipfectamine 2000)法分别转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达，经G418筛选稳定细胞克隆，采用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)检测筛选CD59蛋白高表达株。
ELISA：收获并裂解细胞,测定并调节标本和对照蛋白质浓度为10 mg/L,用包被液以1∶1、1∶2、1∶4稀释待测标本和空pIRES对照,并分别设6个复孔,每孔加入100 μＬ样品,4 ℃包被18 h,封闭,加入羊抗人ＣＤ59抗体后,加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG用3,3′?二氨基联苯胺盐酸盐(ＤＡＢ)显色,测定450 nm波长处吸光度（A）值。
1.3 Caspase?3、Bcl?2免疫组织化学染色
取培养的对数生长期的细胞，以每孔5×105个接种于6孔培养板（每孔铺有一块盖玻片）。培养48 h后，取出盖玻片用40 g/L的多聚甲醛固定，进行免疫组化染色。按照试剂盒的说明书操作。
1.4 结果判定
Caspase?3阳性染色定位于细胞浆，Bcl?2蛋白阳性表达定位于胞膜及（或）胞浆，均呈棕黄色染色。参照 FRORMOWITZ等[6]的方法，随机选取5个高倍视野（400倍），首先根据阳性细胞所占的百分比计分，阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。再根据阳性细胞显色强度计分：无着色为0 分，轻度染色为1分，中度染色为2分，重度染色为 3 分。两者得分之和即为阳性蛋白表达，其中<1分为阴性，2～3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（?），6～7分为强阳性（?）。
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