牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(8)

　　本实验表达的His-FimA融合蛋白编码353个氨基酸（菌毛蛋白347个氨基酸，His标签6个氨基酸），在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达时，经蛋白表达形式分析证实表达的融合蛋白位于包涵体中。蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达，常常导致形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体。包涵体是由外源蛋白与周围杂蛋白或核酸等形成的不溶性的凝聚体，含大部分的表达蛋白。这些由表达蛋白聚集成的包涵体很容易与可溶性蛋白和膜蛋白分离。高水平表达外源蛋白的细菌经离心浓缩后，可通过机械法、超声处理法或溶菌酶加去污剂的方法进行裂解。包涵体经离心沉淀后可用Triton-100和EDTA或用尿素洗涤。洗涤的目的是尽可能从聚集的外源蛋白中除去可溶的、粘附的细菌蛋白。目前还不能预测外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达时以可溶形式存在，还是聚集成包涵体。根据蛋白质的大小、疏水性和荷电性等，很难预见其表达状态。同时，根据天然蛋白的四级结构进行判断也是不可靠的，因为无论是单体蛋白还是寡聚体蛋白的亚基都能形成包涵体。

　　本实验中表达FimA蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS经离心浓缩后，经含有Tris-Cl和EDTA的缓冲液重悬，然后用溶菌酶进行裂解。裂解后的细菌离心浓缩后，沉淀用含0.5%的Triton-100的缓冲液来洗涤。经SDS-PAGE分析，结果显示表达的融合蛋白主要位于沉淀中，以不溶形式存在于包涵体中。

　　影响基因在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。虽然在15～42℃之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围则可能很窄，只有2～4℃。IPTG的浓度对表达水平影响非常大，1 mmol/L是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中，应在0.01～5.0 mmol/L的范围内改变IPTG的浓度，寻找最佳使用浓度。受实验条件限制，本实验在30℃，用2 mmol/L IPTG，3 h的条件来诱导靶蛋白的表达，靶蛋白能够得到正确的表达。如果条件允许，应该选择不同的温度、不同的IPTG浓度和时间来摸索最佳诱导条件，以达到最优的表达效果。

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