牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(6)

　　　　　　　　　　　图3.5  pET-15b-fimA的诱导表达分析

　　1：pET-15b-fimA，2 mmol/L IPTG诱导3 h；  2：pET-15b-fimA，2 mmol/L IPTG诱导2 h；

　　3：pET-15b-fimA，2 mmol/L IPTG诱导1 h；  4：pET-15b-fimA，1 mmol/L IPTG诱导3 h；

　　5：pET-15b-fimA，1 mmol/L IPTG诱导2 h；  6：pET-15b-fimA，1 mmol/L IPTG诱导1 h；

　　7：pET-15b, 2 mmol/LIPTG诱导3 h；        M：预染蛋白质MarkerⅢ

　　3.3.4蛋白免疫印迹（Western blot）的结果
　　融合表达的目的蛋白His-FimA带有His标签，因此，6×His-FimA表达产物经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜，以鼠抗6×His Tag单克隆抗体为一抗，采用山羊抗鼠的种属特异性抗体为二抗，ECL底物化学发光试剂盒显色，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带（图3.6）。实验结果表明，重组质粒pET-15b-fimA在E.coli BL21(DE3)pLysS中获得正确表达。　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　图3.6  融合蛋白表达产物的western blot鉴定

　　1：pET-15b   2：pET-15b-fimA

　　3.3.5 蛋白表达形式分析
　　诱导菌裂解后，分离上清（上清1）和沉淀（沉淀1），沉淀经处理后，将得到的上清（上清2）和沉淀（沉淀2）以及上清1一起走蛋白电泳分析，结果显示（图3.7），表达的融合蛋白位于沉淀中，主要以不溶性形式存在于包涵体中。

　　　　　　　图3.7  FimA表达形式分析

　　A：上清2；B：上清1；C：包涵体沉淀

　　M：预染蛋白质MarkerⅢ

　　3.4 讨论
　　研究蛋白质的功能及制备抗体，必须获得目的蛋白。获得目的蛋白的途径有两种，一是利用蛋白的物理、化学特性从生物体内直接提取、纯化；另一种是利用基因工程技术构建表达载体，使目的基因在体外宿主细胞中大量表达目的蛋白。与直接从生物体内提取、纯化生物大分子相比，后一种技术既简便又高效。

　　基因工程又称重组DNA技术、遗传工程、分子克隆，指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行剪切和重新连接，或将DNA分子中某个（些）位点进行人工替换或删除，改造基因结构，然后利用转化、转染、感染等方法将重组的DNA片段导入宿主细胞，使DNA片段得到扩增。将目的基因在受体细胞内表达，产生目的蛋白产物。基因工程为蛋白质的研究提供了极大方便，使那些表达量少，又难以纯化的蛋白质得以大规模制备，也使获得自然界并不存在的蛋白质成为可能[63,117]。

　　为使重组DNA在宿主中表达，有原核细胞表达外源基因和真核细胞表达外源基因两种体系。真核表达系统虽然有蛋白翻译后加工机会多, 甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染, 具有遗传稳定性和可重复性等优点，但是利用真核表达系统难以使基因得到高效表达。基因高效表达是一个非常复杂的问题，它受DNA拷贝数、转录有效性、mRNA的加工转运及稳定性、转译有效性以及蛋白质加工、分泌及稳定性等多方面因素的影响，而且高效表达不同基因之限速因素又不尽一致。目前,对真核生物基因表达的研究远远不如对原核生物的研究深入。其原因主要有：真核生物基因组成和形态结构复杂，难以直接测定基因产物和基因控制的生化过程；难以选择影响调控基因的突变体；难以通过改变外界环境条件来研究分析基因表达的变化；难以直接进行基因操作等。与真核表达系统相比，原核表达系统具有培养简单、迅速、经济、表达效率高、表达稳定和容易纯化等优点。大肠杆菌是最常用的原核表达体系，一个好的大肠杆菌表达体系应该满足以下几个标准[71]：①尽可能低的诱导前泄漏表达；②快速简便的诱导方式；③能够高效表达多种基因；④易于进行克隆操作；⑤能直接进行点突变和DNA序列分析而不要亚克隆，从而满足蛋白质工程研究的需要。

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