牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(7)

　　在现有实验条件和经济条件下，为了得到高表达量和生物学活性好的FimA蛋白，本实验选用原核表达载体pET-15b在原核表达体系大肠杆菌中进行融合表达。融合表达是将外源目的基因与另一基因构建成融合基因进行表达。该表达方式的特点有[71,118]：①由于转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制，因而融合蛋白通常较易获得高效表达。②外源序列与大肠杆菌基因的融合导致其融合蛋白通常较天然的外源蛋白稳定。另外融合蛋白表达也是纯化重组蛋白较简单易行的方法。

　　融合蛋白（fusion protein）是指表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末端是由克隆的真核DNA编码。这样表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起，故称为融合蛋白。在表达融合蛋白时，为了得到正确编码的表达蛋白，在插入外源基因时，其阅读框架应与原核DNA片段的阅读框架一致，这样，插入的外源基因在翻译时才不致产生移码突变。融合蛋白具有极大的应用潜力[71]：①靶蛋白附着于已知酶功能和/或抗原组成的结构域，可以简化靶蛋白的标记与分离；②靶蛋白与信号肽连接，可以将融和蛋白分泌到特定的细胞区；③运载蛋白能保护靶蛋白免受原核宿主的蛋白酶解作用；④运载蛋白可以改善靶蛋白的溶解性，防止形成不溶性包涵体。

　　在前期实验中，本课题组将克隆的Pg的fimA基因片段连接入pET-15b原核融合表达载体，按正确的读框插入多克隆位点，成功的构建了重组质粒pET-15b-fimA。本实验将此重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析，在分子量为41 kDa处出现一条新生的蛋白带，与预期的融合蛋白大小相符。表达产物经Western blot分析，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。这些实验结果说明fimA基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了正确表达。

　　对于某一种特定蛋白质的表达，选择大肠杆菌系统时主要从以下几个方面考虑[71]：①蛋白质的大小：小的胞质蛋白和多肽（长度小于100个氨基酸残基）最好能通过标准肽键与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列通常能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解；并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位点进行切割，可以回收到具有活性的靶蛋白。在任何系统中表达长度大于100个氨基酸残基的胞质蛋白质都非常困难。在大肠杆菌中，这些蛋白质常常不稳定而形成包涵体；在哺乳动物细胞中，困难在于如何将外源蛋白和它的内源同系物区分开来。②蛋白质的需要量：如果只需要少量的靶蛋白，比如筛选系列点突变蛋白寻找酶的活性位点，那么多数标准表达质粒都可以满足需要；而如果活性蛋白需要纯化和/或蛋白质的需要量很大，就有必要试验不同的宿主－载体系统和纯化方法，最终确定一个最适合大规模表达的方案。③蛋白质是否需要保留活性：如果表达靶蛋白的目的只是用于产生抗体，就不一定要获得活性蛋白，而可以选择便于靶蛋白纯化的表达系统，不管其是以活性形式还是变性状态存在，包涵体的形成对不溶性蛋白质的分离非常有利。如果靶蛋白是用于生物化学或细胞生物学研究，那么保持或恢复蛋白质的功能就非常重要，而是否易于纯化就是次要的了。有时表达产物本身就是活性的可溶性蛋白，而多数情况下表达产物是不溶的，必须经过从包涵体中纯化、溶解和再折叠才能恢复活性形式。如果表达蛋白是用于结构研究，最好能以可溶状态表达。

　　本实验所用的pET-15b载体属于pET载体系列。这类载体是Studier等于1990年首先构建的。在这种载体中，外源编码基因在多克隆位点插入，置于天然T7噬菌体RNA聚合酶启动子的控制之下，外源基因的表达受T7 RNA聚合酶调控。T7 RNA聚合酶的转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA、大量表达目的蛋白。T7 RNA聚合酶/启动子表达系统还有一个特点，就是需用不同的宿主菌进行外源基因的克隆和表达。特别是在外源基因表达产物是宿主菌的毒性蛋白时，在同一宿主菌进行克隆和表达会很困难，有时是不可能的。本课题组前期实验构建融合表达载体的过程中，用于克隆的宿主菌TOP10不表达T7 RNA聚合酶，宿主菌的其他RNA聚合酶不识别T7 RNA启动子，fimA基因得不到表达，不会对宿主菌造成影响，从而保证了fimA基因克隆的顺利进行。本实验用宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS来表达fimA基因。由于正常大肠杆菌并不表达T7 RNA聚合酶，为了能利用T7启动子表达外源基因，研究者已将T7 RNA聚合酶置于lacUV5启动子的控制下，整合到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS染色体中，从而能诱导表达T7 RNA聚合酶[63]。

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说理学类牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(7)在线全文阅读。