1）4℃，12000 r/min离心OD值超过0.6的菌液2ml，弃掉上清，倒扣在滤纸上流尽残余的上清。
2）加250 μl溶液P1，充分振荡混匀至彻底悬浮。
3）加250 μl溶液P2，温和的上下翻转6～8次使菌体充分裂解。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min。
4）加350 μl溶液P3，温和的上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，4℃，12000 r/min离心10 min，收集离心后得到的上清。
5）将上一步所得的上清加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 r/min离心30 s，弃去收集管中的废液。
6）加500 μl去蛋白液PD，12000 r/min离心30 s，弃掉废液。
7）加700 μl漂洗液PW（已加入无水乙醇），12000 r/min离心30 s，弃掉废液。
8）加500 μl漂洗液PW，12000 r/min离心30 s，弃掉废液。
9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000 r/min离心2 min，尽量除去漂洗液。
10）取出吸附柱CB3，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100 μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴预热），室温放置15 min，12000 r/min离心1 min。将1.5 ml离心管（DNA溶液）于－70℃保存。
取5 µl质粒DNA，10 g/L TBE琼脂糖凝胶80 V、40 mA电泳检测DNA。设立marker对照。待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，在紫外灯下观察拍照。
3.2.2 E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞的制备
采用低温CaCl2制备感受态细胞的方法制备大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞。步骤如下：
1）从37℃培养16～20 h的平板上挑取一个单菌落（直径2～3 mm），转到一个含有50 ml LB液体培养基的250 ml锥形瓶中，37℃，220 r/min振摇培养3 ～4 h，至A600大约为0.6。
2）将细菌转移到一个高压灭菌、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3）4℃，4100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4）倒出培养液，将管倒置1 min使最后的痕量培养液流尽。
5）用30 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液（80 mmol/L MgCl2 ,20 mmol/L CaCl2）重悬细胞沉淀。
6）4℃，4100 r/min离心10 min，以回收细胞。
7）倒出培养液，将管倒置1 min使最后的痕量培养液流尽。
8）用2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀。
9）加入高压灭菌后的50%甘油，配成含甘油20％～25%的悬液，分装100 µl/支于eppendorf管中，－70℃冻存。
3.2.3 空质粒和重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞
1）制备含Amp（50 µg/m1）的15 g/L琼脂－LB固体培养基平板。
2）取冻存于－70℃的E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞在流水下快速解冻（不可震动）。
3）将提取的空质粒和重组质粒各10 µl分别加入两支感受态细胞中，轻轻吹打混匀。
4）冰浴30 min后，置预热后的精密水浴锅42℃热休克90 s，立即移入冰水中放置2 min。
5）分别加入37℃预热后的LB液体培养基（不含抗生素）500 µl，37℃摇床150 r/min温和振摇60 min，使细胞复苏。
6）将离心管内容物混匀，分别吸取100 µl 已转化的感受态细胞加到两个含Amp（50 µg/m1）的15 g/L琼脂－LB固体培养基平板上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。
7）将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12～16 h。
3.2.4 从E.coli BL21(DE3)pLysS中提取质粒pET15b和pET-15b-fimA
从培养平板中挑选氨苄青霉素抗性菌落，分别接种入5 m1 LB培养基中(含Amp l00 μg/m1)，37℃振荡培养16h，质粒小提试剂盒分别提取质粒DNA。步骤如3.2.1中所示。
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