牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（(5)

　　6）一抗结合：按照抗体说明书，用TBST将抗His标签的抗体稀释2000倍，弃去TBST，将膜放入一个自封袋内加一抗（0.1 ml/cm2膜面积）排出气泡，封口，4℃冰箱过夜。

　　7）洗膜：弃去一抗，TBST洗3次，每次15 min。

　　8）二抗结合：按照抗体说明书，用TBST将HRP标记的山羊抗鼠IgG稀释2000倍，弃去TBST，将膜放入一个自封袋内加二抗（0.1 ml/cm2膜面积）排出气泡，37℃恒温箱孵育1小时。

　　9）洗膜：弃去二抗，TBST洗3次，每次15 min。

　　10）用吸水纸吸干膜上的水分。

　　11）显色：按ECL底物化学发光试剂盒说明书配发光检测液，用吸管将配制的发光检测液转移到NC膜上，使其均匀覆盖，室温孵育5分钟。

　　3.2.7 蛋白表达形式分析
　　1）取100ml 转化了pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS诱导菌液于预先称重的离心管中4℃，5500 r/min离心15 min。

　　*注意*：步骤2～4在4℃下进行。

　　2）弃去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入3 ml细胞裂解缓冲液Ⅰ（50 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0，100 mmol/L NaCl），轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

　　3）每克（湿重）菌体加入4 µl 100 mmol/L PMSF，80 µl 10 mg/ml溶菌酶，搅动20 min。

　　4）每克（湿重）菌体加入4 mg脱氧胆酸钠，继续搅动。

　　5）悬液37℃放置，不时用玻璃棒搅动，待其变黏时，每克（湿重）菌体加入20 µl 1 mg/ml DNaseⅠ。

　　6）裂解液室温放置，直至不再黏稠（约30 min）。

　　7）细胞裂解液4℃高速离心15 min。

　　8）倾倒去除上清，留置待用，此为上清1，沉淀重悬于9倍体积的4℃细胞裂解缓冲液Ⅱ（50 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，10 mmol/L EDTA pH 8.0，100 mmol/L NaCl，0.5%Triton-100）。

　　9）悬液室温放置5 min。

　　10）4℃高速离心15 min。

　　11）倾倒上清，留置待用，此为上清2。沉淀重悬于100 μ1水。

　　12）各取10 µl上清1、上清2、沉淀，分别与10 µl 2×SDS凝胶加样缓冲液（Loading Buffer）混合，用12％分离胶和5％浓缩胶SDS-PAGE分析靶蛋白的分布。

　　3.3结果 3.3.1 从E.coli Top10中提取质粒pET15b与pET-15b-fimA
　　电泳结果示（图3.3），在5500 bp附近和5500 bp~7000 bp之间各有一单一条带，与预期大小5708 bp和6755 bp一致。

                   图3.3  pET-15b和pET-15b-fimA质粒电泳图

　　1：pET-15b   2：pET-15b-fimA

　　M：Marker Ⅳ(从上到下7000，5500，3500，2000，1000，500 bp)

　　3.3.2 从E.coli BL21(DE3)pLysS中提取质粒pET15b和pET-15b-fimA
　　电泳结果示（图3.4）在5500 bp附近和5500 bp~7000 bp之间各有一单一条带，与预期大小5708 bp和6755 bp一致。          

　　　　　　　　图3.4  pET-15b和pET-15b-fimA质粒电泳图

　　1：pET-15b   2：pET-15b-fimA

　　M：Marker Ⅳ(从上到下7000，5500，3500，2000，1000，500 bp)

　　3.3.3 重组质粒pET-15b-fimA的诱导表达分析
　　重组转化菌按前述程序经IPTG诱导表达后，在41 kDa处显示融合表达蛋白条带，而空质粒pET-15b在该处无特异条带（图3.5）。融合表达蛋白大小与预期大小基本一致，IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2 mmol/L，诱导时间为3 h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为1 h时蛋白表达量最小。实验结果表明，牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA的1044 bp编码基因在E.coli BL21(DE3)pLysS中已初步获得正确表达。

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