丹红注射液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响(2)

　　1.2睡眠剥夺模型的建立采用小平台水环境法(flower pot)建立大鼠SD模型。参照文献[3]制作大小为30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，中央放一直径为6.5 cm，高8 cm的平台。箱内注有水，水面低于平台2 cm，水温保持在20 ℃左右。大鼠可以在平台上自由摄取食物和水，但当进入快速眼动睡眠(rapid eye movement sleep, REM)时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，如此反复多次造成REM的剥夺。在大鼠活动空间内给予12 h/12 h明暗交替，室内温度控制在18~22 ℃。

　　1.3水迷宫组成Morris水迷宫由北京硕林苑公司生产。包括一直径150 cm、高60 cm的圆形不锈钢水池，内壁黑色，置有直径15 cm、高25 cm的透明有机玻璃平台，以及水迷宫测试系统。实验时，平台隐藏在水下2 cm，水温保持在(22±0.5)℃。池壁上标有东南西北4个入水点，它们将水池划分为4个象限，在任意一象限区中间放置平台，平台没于水下2 cm。水池周围围有窗帘尽量消除外界影响，池壁水面上贴有不同颜色不同形状纸片。在实验过程中，保持环境安静。

　　1.4行为实验实验分为定位航行试验和空间探索试验两个部分。

　　1.4.1定位航行实验(place navigation test，PNT)每天08：00~11：00之间对每只大鼠进行训练，不选平台所在象限作为入水点，按顺时针方向把大鼠面向池壁放入水中，检测大鼠隐匿平台潜伏期。如果在规定的最长时间120 s内未到达平台，则由实验者将其引至平台，逃避潜伏期记为120 s，大鼠在平台休息20 s后进行下1次测试。观察并记录动物找到并爬上平台的潜伏期、游泳路程及游泳轨迹。3 d训练结束后将大鼠按组别放入睡眠剥夺箱。SD时间点到后进行最后1次PNT，记录平均潜伏期、平均游泳路程作为该只大鼠所得成绩。

　　1.4.2空间探索实验 (spatial probe test，SPT)各组大鼠最后1次PNT后撤除平台，将大鼠从最后1次入水点面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宫中连续游泳，记录大鼠120 s内穿越原平台平面的次数。

　　1.5海马GFAP的测定各组大鼠最后1次水迷宫测试完后，在10%水合氯醛麻醉下用0.9%生理盐水200 ml经心脏快速灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(用0.1 MPB配制，pH7.2~4.4)200 ml灌注取脑后固定。包埋，定位海马，冠状面切片，片厚3 μm;抗原热修复后依次加入3% H2O2、10%山羊血清封闭液，各在37 ℃温箱孵育10 min，加入1∶100 GFAP抗体，于4 ℃冰箱过夜，滴加二抗工作液及辣根酶，DAB显色，光镜下观察胞质呈棕黄色为阳性细胞。对照组染色步骤相同，阴性对照用PBS代替一抗。

　　1.6数据处理切片在统一放大倍数(10×40)下随机选5个视野，输入图像分析系统，以光密度值(Optical density)表示GFAP的含量，计算其均值。实验数据均采用SPSS16.0软件进行统计，进行单因素方差分析和组间t检验。

　　2结果

　　2.1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试各组大鼠SD后Morris水迷宫测试游泳潜伏期及路程均延长，实验组和对照组不同SD时间之间有统计学差异(P<0.01)，穿越平台次数下降不明显(P>0.05)。与对照组相比，实验组2，3 d及5 d组潜伏期缩短(P<0.05)，4 d组潜伏期缩短(P<0.01);实验组2 d及5 d组游泳路程缩短(P<0.05)，3 d及4 d组游泳路程缩短(P<0.01);实验组及对照组之间，穿越平台次数无明显变化(P>0.05)，差异无统计学意义(表1～3及图1~3)。表1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试潜伏期比较图1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试潜伏期比较表2睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试路程比较

　　2.2睡眠剥夺大鼠海马组织GFAP的检测各组大鼠SD后海马中GFAP含量均增高，实验组和对照组不同SD时间之间有统计学差异(P<0.01)，形态学上表现为海马区GFAP阳性细胞增多，胞体变大，突起增粗增长。与对照组相比，实验组2 d及3 d组GFAP含量增高(P<0.05)，4 d及5 d组GFAP含量增高(P<0.01)，实验组和对照组之间有统计学差异(表4及图4)。

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