1.3 半定量RT?PCR
细胞总RNA的提取：用TRIzol提取细胞总RNA。经MMLV逆转录酶合成cDNA，以逆转录产物加dNTPs、PCR Buffer、mdr1引物进行PCR，取PCR产物定量10 μL 扩增产物，25 g/L琼脂糖凝胶电泳，灌胶前加EB（1 mL 1×TAE 加1 μL EB），75 V，30～60 min，紫外线灯下观察并照相，用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software及GD?1数字化凝胶成像分析仪扫描，计算mdr1基因与β?actin的比值。
1.4 统计学处理
应用医学统计学软件SPSS 12.0处理，结果用±s表示，数据间比较用F检验及χ2检验。
2 结 果
2.1 AML病人mdr1基因的表达
AML?P组、AML?C组、AML?R组和对照组mdr1基因表达值分别为0.78±0.76、0.54±0.45、1.64±1.75、0.20±0.13，AML病人mdr1基因表达值高于对照组，且AML?R组高于AML?P组、AML?C组，差异有显著性(P<0.001)。见图1。
图1 mdr1基因表达的RT?PCR检测
①Marker；②AML?P；③AML?R；④AML?C；⑤AML?M5；⑥Normal；⑦K562/A02；⑧K562
根据对照组和AML各组mdr1基因在不同组别的表达，将mdr1/β?actin的比值≥1.0定为mdr1基因阳性表达，对照组mdr1与β?actin比值均<0.1，根据此标准，AML?R组mdr1基因阳性表达率显著高于AML?P组和AML?C组，差异有显著性（χ2=9.578、8.324，P<0.05）。见表1。表1 各组AML病人mdr1基因阳性表达组别n阳性例数阳性率AML病人临床耐药组mdr1基因阳性表达率显著高于非临床耐药组，差异有显著性（χ2=32.42，P<0.01），CR率非临床耐药组显著高于临床耐药组，差异有显著性（χ2=49.63，P<0.01）。见表2。
表2 AML病人mdr1基因表达与临床耐药的关系组 别nmdr1阳性(例)表达率(χ%)CR(例)CR率(χ%)临床耐药251768.0416.0非临床耐药40410.03895.0 3 讨 论
白血病细胞对多种化疗药物产生耐药性是造成白血病化疗失败的主要原因，是血液肿瘤治疗亟待解决的问题。关于MDR的形成机制，近来已成为国内外研究的热点之一。近30年的研究发现，多药耐药的机制非常复杂，其中多药耐药基因mdr1编码的P?糖蛋白（P?gp）的阳性表达被认为是血液肿瘤耐药产生的主要机制[3]。推测P?gp可能通过3种方式引起MDR：①药物被动扩散入细胞后，在浆膜面与P?gp结合并被泵至细胞外；②基于许多抗癌药物均具有亲脂疏水的特点，认为药物与P?gp在脂质双分子层内结合，未进入肿瘤细胞即被泵出；③进入胞内的药物由P?gp泵入胞质内膜腔，再通过出胞作用排出细胞。P?gp在人体大多数正常的组织中均低表达，而在MDR细胞中高表达，且P?gp表达的增加与MDR耐药株的耐药程度呈正相关。LOO等[4]的研究表明,P?gp与药物的结合是一种底物诱导契合机制，这种机制决定了P?gp具有能作用于大范围的不同结构化合物的特性。总之，P?gp可对多种化疗药物产生耐药，从而造成化疗失败。因此，检测AML病人mdr1基因的表达对于了解病人的耐药情况，采取逆转耐药与化疗同时进行治疗具有一定的临床意义。
本文应用RT?PCR检测了65例AML病人和对照组mdr1基因的表达情况，与大多数报道不同的是，我们分组研究了初发、CR和复发难治AML病人mdr1基因的表达，研究结果显示,AML病人mdr1基因的表达阳性率高于对照组；复发难治组mdr1阳性表达率显著高于初诊组和缓解组，mdr1基因在复发组中表达率高，提示经过长期化疗的筛选，耐药细胞株存活或者经药物诱导产生耐药，是复发组急性白血病诱导缓解率低、预后差的原因。吴少玲等[5]的研究显示,急性白血病病人mdr1表达明显高于对照组，孟繁军等[6]研究也表明复发组和临床耐药组表达水平明显高于初治组和完全缓解组。另有研究显示，P?gp阳性白血病细胞内DNR/Rh123的浓度显著低于P?gp阴性细胞，并且细胞内DNR/Rh123的浓度随着样本P?gp阳性率的增加而降低[7]。
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