舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型妊娠大鼠、胎鼠宫内发育的干预(2)

　　2 方法

　　2.1 动物模型的建立 按文献法[2～5]，对模型组及药物干预组孕鼠进行慢性心理应激实验。孕鼠接受的应激包括：(1)束缚筒束缚，2h/次，3次/d。(2)程控穿梭箱声-电刺激，刺激参数为①声：强度为65 dB，每循环持续60 s，3循环/次，9循环/d;②电：足底电击电流强度为3 mA，每循环持续65 s，3循环/次，9循环/d。连续刺激至动物处死，应激实验环境与饲养环境分开，正常组孕鼠不给予刺激，孕鼠受刺激后出现尖叫、直立、挠腮、撕咬、蜷缩、饮食减少、大便稀薄、体重下降，提示肝郁模型建立。

　　2.2 给药剂量与方法正常组给予蒸馏水灌胃，10 ml/kg，1次/d,连续18 d。模型组造模后给予蒸馏水灌胃，10 ml/kg，1次/d，连续18 d。舒肝健脾补肾高剂量组造模后给予舒肝健脾补肾方浸膏稀释液灌胃，13.12 g/ kg·d，相当于成人剂量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，连续18天。舒肝健脾补肾低剂量组造模后给与舒肝健脾补肾方浸膏稀释液灌胃，6.56 g/k g·d，相当于成人剂量的6.7倍，10 ml/kg，1次/d，连续18d。滋肾育胎丸组：造模后常规饲养,给予滋肾育胎丸稀释液灌胃，2.42 g/ kg·d，相当于成人剂量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，连续18 d。

　　2.3 检测指标及方法

　　2.3.1 一般状态及自主活动的观察 分组后，开始仔细观察和记录各组孕鼠体重及自主活动情况，并作出造模前后孕鼠的体重及自主活动情况变化对比。在心理应激刺激前后，分别进行开放场地实验(敞箱试验，Open-field test，OFT):将受试大鼠放在OFT中心区域，同时开始记录3min内孕鼠穿越格数(以三足踏入同一格为准)，以及孕鼠直立(双前肢离地)次数[6～8]。每只动物仅进行1次测定，3min/次。

　　2.3.2 阴道上皮脱落细胞的观察大鼠合笼后，每天早上8点进行阴道上皮脱落细胞的观察。将沾有生理盐水的棉签轻柔旋人母鼠的阴道(0.5 cm)，旋转一圈以后拿出,再将棉签上沾有的阴道内分泌物涂于清洁的玻片上。稍干，用95%水乙醇固定3～5 min，HE染色，风干。在200×普通光学显微镜下观察，1次/d，直到见到大量云片状上皮细胞中夹有大量精子作为妊娠第1天。

　　2.3.3 血清的测定在妊娠第19天时断头处死孕鼠,取血4～5 ml，静置分层、离心、分离血清，将分离血清储存于-70℃冰箱内。用放射免疫分析法测定P、IGF-1、IGF-2，由河南省中医药研究院放免室检测，按试剂盒说明书操作。

　　2.3.4 子宫蜕膜PR水平的检测将4%多聚甲醛液固定的子宫，常规脱水，浸蜡、包埋，切片厚度5 μm。由河南省肿瘤医院病理实验室检测，严格按照PR免疫组化试剂盒说明书操作。免疫组化法判断标准：每张切片在 200 ×光镜下观察 5 个视野，阳性染色为细胞核或细胞浆内出现棕黄色颗粒。阳性细胞表达占 10～30%为 “+ ”，占50%以上为“+++”，在两者之间为“++”;阴性表达：未见阳性或阳性细胞占5%以下，表达为“-”。

　　2.3.5 胎鼠、胎盘重量在妊娠第19天时断头处死孕鼠，解剖取出胎鼠、子宫、胎盘进行称重。

　　2.4 统计学处理所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料结果以±s描述;符合正态分布计量资料多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q检验，不符合正态分布的采用对数法或倒数法进行转换为正态资料后进行统计分析，多个独立样本非参数检验用等级频数资料分析。

　　3 结果

　　3.1 舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型孕鼠自主活动的影响结果见表1。表1 各组孕鼠敞箱试验中穿越格数及直立次数的影响结果显示造模前各组孕鼠穿越格数经F检验得，F=0.668，P=0.617>0.05，提示造模前各组差别均无意义，具有可比性。造模后舒肝健脾补肾高、低组及阳性药组孕鼠穿越格数显著低于模型组(P<0.01)。正常组孕鼠穿越格数显著低于模型组(P<0.05)。造模前各组孕鼠直立次数经F检验得，F=0.884，P=0.481>0.05，提示造模前各组差别均无意义，具有可比性。造模后正常组、舒肝健脾补肾低组孕鼠直立次数低于模型组(P<0.05);舒肝健脾补肾高组及阳性药组孕鼠直立次数低于模型组(P<0.01)。

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